Reaktioiden mikrobiologia. Likimääräinen agglutinaatioreaktio (RA)

1.1. AGGLUTINAATIOREAKTIO (RA)

AGGLUTINAATIOREAKTIO (RA)

Agglutinaatioreaktio on spesifisyytensä, asettamisen helppouden ja demonstratiivisuutensa ansiosta yleistynyt mikrobiologisessa käytännössä monien tartuntatautien diagnosoinnissa.

Agglutinaatioreaktio perustuu vasta-aineiden (agglutiniinien) vuorovaikutuksen spesifisyyteen kokonaisten mikrobi- tai muiden solujen (agglutinogeenien) kanssa. Tämän vuorovaikutuksen seurauksena muodostuu hiukkasia - agglomeraatteja, jotka saostuvat (agglutinoituvat) hiutaleina.

Agglutinaatioreaktioon voivat osallistua sekä elävät että kuolleet bakteerit, spirokeetat, sienet, alkueläimet, riketsiat sekä punasolut ja muut solut. Reaktio etenee kahdessa vaiheessa: ensimmäinen (näkymätön) spesifinen, antigeenin ja vasta-aineiden yhdistäminen, toinen (näkyvä) epäspesifinen, antigeenien sitoutuminen, ts. agglutinaatin muodostumista.

Agglutinaatti muodostuu, kun kaksiarvoisen vasta-aineen yksi aktiivinen keskus yhdistetään antigeenin determinanttiryhmään. Agglutinaatioreaktio, kuten mikä tahansa serologinen reaktio, etenee elektrolyyttien läsnä ollessa.

Ulkoisesti positiivisen agglutinaatioreaktion ilmenemismuoto on kaksinkertainen. Leiutumattomissa mikrobeissa, joilla on vain somaattinen O-antigeeni, mikrobisolut itse tarttuvat toisiinsa suoraan. Tällaista agglutinaatiota kutsutaan hienorakeiseksi. Se tapahtuu 18 22 tunnin sisällä. v

Leimautuneilla mikrobeilla on kaksi antigeeniä, somaattinen O-antigeeni ja flagellaarinen H-antigeeni. Jos solut tarttuvat yhteen flagellan kanssa, muodostuu suuria irtonaisia ​​hiutaleita ja tällaista agglutinaatioreaktiota kutsutaan karkearakeiseksi. Se tulee 24 tunnin sisällä.

Agglutinaatioreaktio voidaan asettaa sekä spesifisten vasta-aineiden kvalitatiivista ja kvantitatiivista määritystä varten potilaan veri- seerumissa että eristetyn patogeenin lajin määrittämiseksi. v

Agglutinaatioreaktio voidaan asettaa sekä yksityiskohtaiseen versioon, joka mahdollistaa työskentelyn diagnostiseen tiitteriin laimennetun seerumin kanssa, että indikatiivisen reaktion asettamisen muunnelmaan, joka mahdollistaa periaatteessa spesifisten vasta-aineiden havaitsemisen tai sen lajin määrittämisen. taudinaiheuttaja.

Yksityiskohtaista agglutinaatioreaktiota määritettäessä spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi potilaan veriseerumissa otetaan testiseerumi laimennoksena 1:50 tai 1:100. Tämä johtuu siitä, että koko tai hieman laimennetussa seerumissa normaaleja vasta-aineita voi olla läsnä erittäin korkeina pitoisuuksina, jolloin reaktiotulokset voivat olla epätarkkoja. Testimateriaali tässä reaktion muunnelmassa on potilaan veri.

Veri otetaan tyhjään mahaan tai aikaisintaan 6 tuntia aterian jälkeen (muuten veriseerumissa voi olla rasvapisaroita, mikä tekee siitä sameaa ja tutkimukseen sopimatonta). Potilaan veriseerumi otetaan yleensä taudin toisella viikolla, jolloin kyynärlaskimosta kerätään steriilinä 3 4 ml verta (tässä vaiheessa spesifisten vasta-aineiden maksimimäärä on keskittynyt). Tunnettuina antigeeninä käytetään diagnostiikkaa, joka on valmistettu tietyn lajin tapetuista, mutta tuhoutumattomista mikrobisoluista, joilla on spesifinen antigeeninen rakenne.

Kun perustetaan yksityiskohtainen agglutinaatioreaktio patogeenin lajin ja tyypin määrittämiseksi, antigeeni on elävä patogeeni, joka on eristetty testimateriaalista. Immuunidiagnostisen seerumin sisältämät vasta-aineet tunnetaan. v

Immuunidiagnostiikkaseerumi saadaan rokotetun kanin verestä. Kun tiitteri on määritetty (maksimilaimennos, jossa vasta-aineet havaitaan), diagnostinen seerumi kaadetaan ampulleihin, joissa on lisätty säilöntäainetta. Tätä seerumia käytetään tunnistamiseen eristetyn patogeenin antigeenisen rakenteen perusteella.

AGGLUTINAATIOVAIHTOEHDOT

Näihin reaktioihin osallistuvat hiukkasten muodossa olevat antigeenit (mikrobisolut, erytrosyytit ja muut korpuskulaariset antigeenit), jotka tarttuvat yhteen vasta-aineiden kanssa ja saostuvat.

Agglutinaatioreaktion (RA) aikaansaamiseksi tarvitaan kolme komponenttia: 1) antigeeni (agglutinogeeni); 2) vasta-aine (agglutiniini) ja 3) elektrolyytti (isotoninen natriumkloridiliuos).

INDIKAATiivinen (LEVY) AGGLUTINATIOREAKTIO (RA)

Likimääräinen tai lamellimainen RA asetetaan lasilevylle huoneenlämpötilaan. Tätä varten lasille laitetaan erikseen Pasteur-pipetillä pisara seerumia laimennettuna 1:10 1:20 ja kontrollitippa isotonista natriumkloridiliuosta. Pesäkkeet tai päivittäinen bakteeriviljelmä (pisara diagnostiikkaa) viedään molempiin bakteriologisiin silmukoihin ja sekoitetaan perusteellisesti. Reaktiot huomioidaan muutamassa minuutissa visuaalisesti, joskus suurennuslasilla (x5). Positiivisella RA:lla seerumipisarassa havaitaan suuria ja pieniä hiutaleita, ja negatiivisen seerumin ollessa tasaisen samea.

EPÄSUORA (PASSIIVINEN) HEMAGLUTINAATIO (RNHA, RPHA)

Reaktio asetetaan: 1) havaitsemaan polysakkarideja, proteiineja, bakteeriuutteita ja muita hyvin dispergoituneita aineita, riketsiaa ja viruksia, joiden komplekseja agglutiniinien kanssa ei voida nähdä tavallisessa nivelreumassa, tai 2) havaitsemaan vasta-aineita näiden potilaiden seerumista. erittäin hajaantuneet aineet ja pienimmät mikro-organismit.

Epäsuoralla eli passiivisella agglutinaatiolla ymmärretään reaktio, jossa vasta-aineet ovat vuorovaikutuksessa antigeenien kanssa, jotka on aiemmin adsorboitunut inertteihin hiukkasiin (lateksi, selluloosa, polystyreeni, bariumoksidi jne. tai pässin punasolut, I (0) ihmisen veriryhmät).

Passiivisessa hemagglutinaatioreaktiossa (RPHA) erytrosyyttejä käytetään kantajana. Antigeenilla ladatut punasolut tarttuvat yhteen tämän antigeenin spesifisten vasta-aineiden läsnä ollessa ja saostuvat. Antigeenille herkistettyjä erytrosyyttejä käytetään RPGA:ssa punasoludiagnostiikkana vasta-aineiden havaitsemiseen (serodiagnoosi). Jos punasoluihin on ladattu vasta-aineita (erythrocyte antibody diagnosticum), sitä voidaan käyttää antigeenien havaitsemiseen.

Lavastus. Valmista polystyreenitablettien kuoppiin sarja sarjalaimennoksia seerumista. 0,5 ml tunnettua positiivista seerumia lisätään toiseksi viimeiseen kuoppaan ja 0,5 ml suolaliuosta (kontrollit) lisätään viimeiseen kuoppaan. Sitten kaikkiin kuoppiin lisätään 0,1 ml laimennettua punasoludiagnostiikkaa, ravistellaan ja asetetaan termostaattiin 2 tunniksi.

Kirjanpito. Positiivisessa tapauksessa punasolut asettuvat reiän pohjalle tasaisena solukerroksena, jossa on taitettu tai rosoinen reuna (käänteinen sateenvarjo), negatiivisessa tapauksessa ne asettuvat napin tai renkaan muotoon. .

1.2. Neutralointireaktio. LYSIS,
OPSONOFAGOSYYTTINEN REAKTIO, YLIHERKKYYSREAKTIO

EKSOTOKSIININ NEUTRALOINTIREAKTI ANTITOKSIININ KANSSA (RN)

Reaktio perustuu antitoksisen seerumin kykyyn neutraloida eksotoksiinin vaikutus. Sitä käytetään antitoksisten seerumien titraamiseen ja eksotoksiinin määrittämiseen.

Kun seerumia titrataan, tietty annos vastaavaa toksiinia lisätään antitoksisen seerumin eri laimennoksiin. Antigeenin täydellisen neutraloitumisen ja käyttämättömien vasta-aineiden puuttuessa tapahtuu alustavaa flokkulaatiota. Flokkulaatioreaktiota voidaan käyttää seerumin (esimerkiksi difterian) titraamisen lisäksi myös toksiinin ja toksoidin titraamiseen. Toksiinien neutraloinnin reaktiolla antitoksiinin kanssa on suuri käytännön merkitys menetelmänä antitoksisten terapeuttisten seerumien aktiivisuuden määrittämiseksi. Tämän reaktion antigeeni on todellinen eksotoksiini.

Antitoksisen seerumin vahvuus määritetään tavanomaisilla AE-yksiköillä.

1 AU botuliiniseerumia sen määrä neutraloi 1000 DLM botuliinitoksiinia. Neutralointireaktio eksotoksiinin lajin tai tyypin määrittämiseksi (tetanuksen, botulismin, kurkkumätä jne. diagnosoinnissa) voidaan suorittaa in vitro (Ramonin mukaan) ja mikrobisolujen myrkyllisyyttä määritettäessä - geelissä ( Ouchterlonyn mukaan).

Hajotusreaktio (RL)

Yksi immuuniseerumin suojaavista ominaisuuksista on sen kyky liuottaa elimistöön joutuvia mikrobeja tai soluelementtejä.

Spesifisiä vasta-aineita, jotka aiheuttavat solujen liukenemisen (lyysin), kutsutaan lysiineiksi. Antigeenin luonteesta riippuen ne voivat olla bakteriolysiinejä, sytolysiinejä, spiroketolisiinejä, hemolysiinejä jne.

Lysiinit osoittavat vaikutuksensa vain lisätekijän - komplementin - läsnä ollessa. Komplementtia, epäspesifisen humoraalisen immuniteetin tekijänä, löytyy melkein kaikista kehon nesteistä paitsi aivo-selkäydinnesteessä ja silmän etukammion nesteessä. Ihmisen veriseerumissa havaittiin melko korkea ja jatkuva komplementtipitoisuus ja paljon marsun veriseerumissa. Muilla nisäkkäillä komplementin pitoisuus veriseerumissa on erilainen.

Komplementti on monimutkainen heraproteiinien järjestelmä. Se on epävakaa ja romahtaa 55 asteessa 30 minuutin ajan. Huoneenlämmössä komplementti tuhoutuu kahdessa tunnissa. Se on erittäin herkkä pitkäaikaiselle ravistelulle, happojen ja ultraviolettisäteiden vaikutukselle. Komplementtia säilytetään kuitenkin pitkään (jopa kuusi kuukautta) kuivatussa tilassa alhaisessa lämpötilassa. Komplementti edistää mikrobisolujen ja punasolujen hajoamista.

Erottele bakteriolyysin ja hemolyysin reaktio.

Bakteriolyysin reaktion ydin on, että kun spesifinen immuuniseerumi yhdistetään sitä vastaaviin homologisiin eläviin mikrobisoluihin komplementin läsnä ollessa, mikrobit hajoavat.

Hemolyysireaktio koostuu siitä, että kun erytrosyytit altistetaan spesifiselle, niille immuunille seerumille (hemolyyttiselle) komplementin läsnäollessa, punasolut liukenevat, ts. hemolyysi.

Laboratoriokäytännössä hemolyysireaktiota käytetään komplementin tyr:n määrittämiseen sekä diagnostisten komplementin kiinnitystestien tulosten huomioon ottamiseksi. Komplementtiitteri on pienin määrä, joka aiheuttaa erytrosyyttien hajoamisen 30 minuutissa hemolyyttisessä järjestelmässä 2,5 ml:n tilavuudessa. Hajotusreaktio, kuten kaikki serologiset reaktiot, tapahtuu elektrolyytin läsnä ollessa.

YLIHERKKYYS (ALLERGISET) REAKTIOT

Tietyt antigeenimuodot voivat toistuvassa kosketuksessa kehon kanssa aiheuttaa reaktion, joka on periaatteessa spesifinen, mutta sisältää akuutin tulehdusvasteen epäspesifisiä solu- ja molekyylitekijöitä. Ylireaktiivisuuden kaksi muotoa tunnetaan: välittömän tyypin yliherkkyys (ITH) ja viivästynyt yliherkkyys (DTH). Ensimmäinen reaktiotyyppi ilmenee vasta-aineiden osallistuessa, kun taas reaktio kehittyy viimeistään 2 tunnin kuluttua toistuvasta kosketuksesta allergeeniin. Toinen tyyppi toteutetaan tulehduksellisten T-solujen (Tr3) avulla reaktion pääefektoreina, jotka varmistavat makrofagien kertymisen tulehdusvyöhykkeelle, reaktio ilmenee 6-8 tunnin kuluttua ja myöhemmin.

Yliherkkyysreaktion kehittymistä edeltää tapaaminen antigeenin kanssa ja herkistymisen esiintyminen, ts. vasta-aineiden, aktiivisesti herkistyneiden lymfosyyttien ja passiivisesti herkistyneiden muiden leukosyyttien (makrofagien, granulosyytit) sytofiilisten vasta-aineiden ilmaantuminen.

Yliherkkyysreaktioilla on kolme kehitysvaihetta: immunologiset; patokemiallinen; patofysiologinen.

Ensimmäisessä spesifisessä vaiheessa allergeeni on vuorovaikutuksessa vasta-aineiden ja/tai herkistyneiden solujen kanssa. Toisessa vaiheessa aktivoiduista soluista vapautuu biologisesti aktiivisia aineita. Vapautuvat välittäjät (histamiini, serotoniini, leukotrieenit, bradykiniini jne.) aiheuttavat erilaisia ​​perifeerisiä vaikutuksia, jotka ovat ominaisia ​​vastaavalle reaktiolle - kolmannelle vaiheelle.

Neljännen tyypin yliherkkyysreaktiot

Tämän tyyppiset reaktiot johtuvat herkistyneiden Thelpereiden, sytotoksisten Tlymfosyyttien (Tkillers) ja mononukleaarisen fagosyyttijärjestelmän aktivoituneiden solujen patogeenisista solujen välisistä vuorovaikutuksista, jotka johtuvat bakteeriantigeenien pitkäaikaisesta immuunijärjestelmän stimulaatiosta, jolloin kehon immuunivaste on suhteellinen järjestelmä poistaa bakteeripatogeenit sisäisestä ympäristöstä tartuntataudeista. Nämä yliherkkyysreaktiot aiheuttavat tuberkuloosipotilailla tuberkuloosia keuhkoonteloita, niiden kaseoosinekroosia ja yleistä myrkytystä. Ihon granulomatoosi tuberkuloosissa ja spitaali morfopatogeneettisesti koostuvat suurelta osin neljännen tyypin yliherkkyysreaktioista.

Tunnetuin esimerkki tyypin 4 yliherkkyysreaktiosta on Mantoux-reaktio, joka kehittyy ihonsisäisen tuberkuliinin annostelukohdassa potilaalle, jonka keho ja järjestelmä on herkistynyt mykobakteeriantigeeneille. Reaktion seurauksena muodostuu tiheä hyperemia, jonka keskellä on nekroosi, joka ilmestyy vain muutaman tunnin kuluttua (hitaasti) tuberkuliinin intradermaalisen annon jälkeen. Papulin muodostuminen alkaa verenkierron mononukleaaristen fagosyyttien ulostulolla verisuonikerroksesta solujen välisiin tiloihin. Samanaikaisesti alkaa polymorfonukleaaristen solujen poistuminen verisuonikerroksesta. Sitten neutrofiilien infiltraatio laantuu ja infiltraatti alkaa koostua pääasiassa lymfosyyteistä ja mononukleaarisista fagosyyteistä. Tämä on ero Mantoux-reaktion ja Arthus-reaktion välillä, jossa pääasiassa polymorfonukleaariset leukosyytit kerääntyvät vauriokohtaan.

Neljännen tyypin yliherkkyysreaktioissa herkistyneiden lymfosyyttien pitkäaikainen stimulointi antigeeneillä johtaa patologisesti voimakkaaseen ja pitkäkestoiseen sytokiinien vapautumiseen T-auttajilla paikoissa, joissa on patologisia muutoksia kudoksissa. Sytokiinien intensiivinen vapautuminen kudosvauriopaikoissa aiheuttaa siellä sijaitsevien mononukleaaristen fagosyyttien järjestelmän solujen hyperaktivoitumista, joista monet muodostavat hyperaktivoituneessa tilassa olevia epiteelisoluja, ja jotkut sulautuvat toisiinsa muodostaen jättisoluja. Makrofagit, joiden pinnalle altistuvat bakteeri- ja virusantigeenit, voivat tuhoutua Tkillerien (luonnollisten tappajien) toiminnan kautta.

Neljännen tyypin yliherkkyysreaktio indusoituu sille, että sille herkistyneet T-auttajat tunnistavat vieraan bakteeriantigeenin. Tunnistamisen välttämätön edellytys on indusoijien vuorovaikutus antigeenien kanssa, jotka altistuvat antigeeniä esittelevien solujen pinnalle endosytoosin ja vieraiden immunogeenien käsittelyn jälkeen mononukleaaristen fagosyyttien toimesta. Toinen välttämätön ehto on antigeenien altistuminen yhdessä luokan I molekyylien kanssa pääkudosyhteensopivuuskompleksista. Antigeenitunnistuksen jälkeen herkistyneet auttajat vapauttavat sytokiineja ja erityisesti interleukiini2:ta, joka aktivoi luonnollisia tappajia ja mononukleaarisia fagosyyttejä. Aktivoidut mononukleaariset fagosyytit vapauttavat proteolyyttisiä entsyymejä ja vapaita happiradikaaleja, jotka vahingoittavat kudoksia.

Ihoallergiset testit selvittävät elimistön herkistymistä allergeeneille, määrittävät sen tartunnan, esimerkiksi tuberkuloosin, luomistaudin, lauman immuniteettitason, esimerkiksi tularemiaa vastaan. Allergeenin leviämispaikan mukaan on: 1) ihotestejä; 2) karsiminen; 3) ihonsisäinen; 4) ihonalainen. Kliininen reaktio allergeeniin ihoallergisessa testissä jaetaan paikalliseen, yleiseen ja fokaaliseen sekä välittömään ja viivästyneeseen.

HIT:n välittäjätyypin paikalliset reaktiot ilmaantuvat 5-20 minuutin kuluttua, ilmaistaan ​​punoituksena ja rakkulana, häviävät muutaman tunnin kuluttua, arvioidaan plus-menetelmällä punoituksen määrällä, mitattuna mm. Paikalliset hormonikorvaushoidon reaktiot ilmaantuvat 24–48 tunnin kuluttua, kestävät pitkään, näkyvät infiltraattina, joskus keskellä nekroosia, ja ne arvioidaan infiltraatin koon millimetreinä, myös plus-järjestelmän perusteella. Sytotoksisissa ja immunokompleksityypeissä GNT:ssä hyperemiaa ja infiltraatiota havaitaan 3-4 tunnin kuluttua, maksimi saavutetaan 6-8 tunnin kuluttua ja häviää noin vuorokauden kuluttua. Joskus havaitaan yhdistettyjä reaktioita.

1.3. TÄYDENTÄVÄ SIDOSTUSREAKTIO (CFR)

Tätä reaktiota käytetään laboratoriotutkimuksissa eri infektioiden vasta-aineiden havaitsemiseen veren seerumissa sekä taudinaiheuttajan tunnistamiseen antigeenisen rakenteen perusteella.

Komplementin kiinnitystesti on monimutkainen serologinen testi, ja sille on ominaista korkea herkkyys ja spesifisyys.

Tämän reaktion piirre on, että muutos antigeenissä sen vuorovaikutuksen aikana spesifisten vasta-aineiden kanssa tapahtuu vain komplementin läsnä ollessa. Komplementti adsorboituu vain vasta-aine-antigeenikompleksiin. Vasta-aine-antigeenikompleksi muodostuu vain, jos antigeenin ja seerumissa olevan vasta-aineen välillä on affiniteetti.

Komplementin adsorptio "antigeenivasta-aine" -kompleksiin voi vaikuttaa antigeenin kohtaloon eri tavoin sen ominaisuuksista riippuen.

Jotkut antigeenit käyvät läpi teräviä morfologisia muutoksia näissä olosuhteissa aina liukenemiseen asti (hemolyysi, Isaev-Pfeifer-ilmiö, sytolyyttinen vaikutus). Toiset muuttavat liikkeen nopeutta (treponema immobilisaatio). Toiset taas kuolevat ilman rajuja tuhoisia muutoksia (bakterisidinen tai sytotoksinen vaikutus). Lopuksi komplementin adsorptioon ei välttämättä liity muutoksia antigeenissä, jotka ovat helposti havaittavissa.

Mekanismin mukaan RSC etenee kahdessa vaiheessa:

1. Ensimmäinen vaihe on "antigeenivasta-aine" -kompleksin muodostuminen ja adsorptio tähän komplementtikompleksiin. Vaiheen tulos ei ole visuaalisesti näkyvä (antigeenin ja vasta-aineiden vuorovaikutus komplementin pakollisen osallistumisen kanssa).
2. Toinen vaihe on muutos antigeenissä spesifisten vasta-aineiden vaikutuksesta komplementin läsnä ollessa. Vaiheen tulos voi olla visuaalisesti näkyvä tai ei-näkyvä (reaktiotulosten havaitseminen indikaattorihemolyyttisellä järjestelmällä (lampaiden punasolut ja hemolyyttinen seerumi).

Hemolyyttisen seerumin aiheuttama punasolujen tuhoutuminen tapahtuu vain, jos komplementti kiinnittyy hemolyyttiseen järjestelmään. Jos komplementti adsorboitui aikaisemmin antigeeni-vasta-ainekompleksiin, punasolujen hemolyysiä ei tapahdu.

Kokeen tulos arvioidaan merkitsemällä hemolyysin esiintyminen tai puuttuminen kaikissa koeputkissa. Reaktiota pidetään positiivisena, kun hemolyysi viivästyy täydellisesti, kun koeputkessa oleva neste on väritöntä ja punasolut laskeutuvat pohjalle, negatiiviseksi, kun punasolut hajoavat täydellisesti, kun neste on voimakkaan värinen ("lakkaveri"). Hemolyysiviiveen aste arvioidaan riippuen nesteen värin intensiteetistä ja erytrosyyttisedimentin määrästä pohjassa (++++, +++, ++, +).

Siinä tapauksessa, että antigeenin muutokset eivät ole käytettävissä visuaalista tarkkailua varten, on tarpeen käyttää toista järjestelmää, joka toimii indikaattorina, jonka avulla voit arvioida komplementin tilan ja tehdä johtopäätöksen reaktion tuloksesta.

Tätä indikaattorijärjestelmää edustavat hemolyysireaktion komponentit, joihin kuuluvat lampaiden punasolut ja hemolyyttinen seerumi, jotka sisältävät spesifisiä vasta-aineita erytrosyyteille (hemolysiinit), mutta eivät sisällä komplementtia. Tämä indikaattorijärjestelmä lisätään koeputkiin tunnin kuluttua pää-CSC:n asettamisesta. Jos komplementin kiinnitysreaktio on positiivinen, muodostuu vasta-aine-antigeenikompleksi, joka adsorboi komplementin itseensä. Koska komplementtia käytetään vain yhteen reaktioon tarvittava määrä ja erytrosyyttien hajoaminen voi tapahtua vain komplementin läsnäollessa, silloin kun se adsorboituu "antigeenivasta-aine" -kompleksiin, punasolujen hajoamista hemolyyttisessä (indikaattori) järjestelmässä ei tapahdu. . Jos komplementin kiinnitysreaktio on negatiivinen, "antigeenivasta-aine" -kompleksia ei muodostu, komplementti pysyy vapaana, ja kun hemolyyttinen järjestelmä lisätään, tapahtuu punasolujen hajoamista.

1.4. DNA PROBES. POLYMERAASI KETJUREAKTIO (PCR),
ENTSYMEIMMUNE METHOD (ELISA), fluoresenssivasta-ainemenetelmä (MFA)

GEENIEN TUTKIMUSMENETELMÄT

Molekyylibiologian intensiivinen kehittäminen ja täydellisen metodologisen perustan luominen geenitutkimukselle ovat nousseet geenitekniikan perustaksi. Diagnostiikan alalla on noussut ja kehittymässä nopeasti suunta DNA:n ja RNA:n spesifisten nukleotidisekvenssien määrittämiseen, ns. geenien tutkimiseen. Tällaiset menetelmät perustuvat nukleiinihappojen kykyyn hybridisoitua muodostaakseen kaksijuosteisia rakenteita komplementaaristen nukleotidien (AT, GC) vuorovaikutuksesta johtuen.

Halutun DNA- (tai RNA-)sekvenssin määrittämiseksi luodaan erityisesti ns. polynukleotidikoetin, jolla on spesifinen emässekvenssi. Sen koostumukseen lisätään erityinen etiketti, jonka avulla voidaan tunnistaa kompleksin muodostuminen.

Vaikka geenien tutkimista ei voida lukea immunokemiallisen analyysin menetelmien ansioksi, sen pääperiaate (komplementaaristen rakenteiden vuorovaikutus) toteutetaan metodisesti samalla tavalla kuin immunodiagnostiikan indikaattorimenetelmiä. Lisäksi geenikoetusmenetelmät mahdollistavat tietojen täyttämisen tartunnanaiheuttajasta sen fenotyyppisen ilmentymisen puuttuessa (genomiin sisäänrakennetut virukset, "hiljaiset" geenit).

DNA-analyysiä varten näyte denaturoidaan, jotta saadaan yksijuosteisia rakenteita, joiden kanssa DNA- tai RNA-koetinmolekyylit reagoivat. Koettimien valmistukseen käytetään joko erilaisia ​​luonnollisesta lähteestä (esimerkiksi yhdestä tai toisesta mikro-organismista) eristettyjä DNA:n (tai RNA:n) osia, jotka yleensä esitetään geneettisinä sekvensseinä osana vektoriplasmideja, tai kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja. Joissain tapauksissa koettimena käytetään fragmenteiksi hydrolysoituneen genomisen DNA:n valmisteita, joskus RNA-valmisteita, varsinkin ribosomaalista RNA:ta. Leimana käytetään samoja indikaattoreita kuin erilaisissa immunokemiallisissa analyyseissä: radioaktiiviset isotoopit, fluoreseiinit, biotooppi (avidinentsyymikompleksin ilmentyessä edelleen) jne.

Analyysin järjestys määräytyy käytettävissä olevan anturin ominaisuuksien mukaan

Tällä hetkellä käytetään yhä enemmän kaupallisia sarjoja, jotka sisältävät kaikki tarvittavat ainesosat.

Useimmissa tapauksissa analyysiprosessi voidaan jakaa seuraaviin vaiheisiin: näytteen valmistelu (mukaan lukien DNA:n uutto ja denaturointi), näytteen kiinnitys kantajalle (useimmiten polymeerikalvosuodattimelle), esihybridisaatio, itse hybridisaatio, sitoutumattomien tuotteiden pesu, havaitseminen. DNA- tai RNA-koettimen standardivalmisteen puuttuessa se ensin hankitaan ja leimataan.

Näytteen valmistelua varten voi olla tarpeen "kasvata" testimateriaalia yksittäisten bakteeripesäkkeiden tunnistamiseksi tai viruspitoisuuden lisäämiseksi soluviljelmässä. Veriseerumi-, virtsa-, verisolu- tai kokoverinäytteiden suora analyysi suoritetaan myös tartunnanaiheuttajan esiintymisen varalta. Nukleiinihappojen vapauttamiseksi solurakenteiden koostumuksesta solut hajotetaan ja joissakin tapauksissa DNA-valmiste puhdistetaan fenolilla.

DNA:n denaturaatio, eli sen siirtyminen yksijuosteiseen muotoon, tapahtuu alkalikäsittelyn aikana. Nukleiinihapponäyte kiinnitetään sitten nitroselluloosa- tai nailonkalvokantajalle, tavallisesti inkuboimalla 10 minuutista 4 tuntiin 80 °C:ssa tyhjiössä. Lisäksi esihybridisaatioprosessissa saavutetaan vapaiden sitoutumiskohtien inaktivointi koettimen epäspesifisen vuorovaikutuksen vähentämiseksi kalvon kanssa. Hybridisaatioprosessi kestää 2-20 tuntia riippuen näytteen DNA:n pitoisuudesta, käytetyn koettimen pitoisuudesta ja sen koosta.

Kun hybridisaatio on suoritettu loppuun ja sitoutumattomat tuotteet on pesty pois, tuloksena oleva kompleksi havaitaan. Jos koetin sisältää radioaktiivisen leiman, kalvo altistetaan valokuvafilmille reaktion ilmentämiseksi (autoradiografia). Käytä muita tarroja varten asianmukaisia ​​menettelytapoja.

Lupaavin on ei-radioaktiivisten (ns. kylmä) luotaintuotanto. Samalla pohjalla kehitetään hybridisaatiotekniikkaa, joka mahdollistaa patogeenin läsnäolon toteamisen leikevalmisteissa, kudospunktioissa, mikä on erityisen tärkeää patomorfologisessa analyysissä (in situ -hybridisaatiossa).

Olennainen vaihe geenikoetusmenetelmien kehittämisessä oli polymeraasin monistusreaktion (PCR) käyttö. Tämä lähestymistapa mahdollistaa tietyn (aiemmin tunnetun) DNA-sekvenssin pitoisuuden lisäämisen näytteessä syntetisoimalla useita kopioita in vitro. Reaktion suorittamiseksi lisätään DNA-polymeraasientsyymivalmistetta, ylimäärä synteesiä varten tarkoitettuja deoksinukleotideja ja niin sanottuja alukkeita, kahden tyyppisiä 20-25 emäksen pituisia oligonukleotideja, jotka vastaavat kiinnostavan DNA-sekvenssin terminaalisia osia. DNA-näyte tutkittavana. Yhden alukkeen on oltava kopio koodaavan DNA-juosteen lukualueen alusta 53-lukusuunnassa ja toisen on oltava kopio ei-koodaavan juosteen vastakkaisesta päästä. Sitten jokaisella polymeraasireaktion syklillä DNA-kopioiden määrä kaksinkertaistuu.

Alukkeiden sitoutumista varten vaaditaan DNA:n denaturaatio (sulatus) 94 °C:ssa, minkä jälkeen seos saatetaan 4055 °C:seen.

Reaktion suorittamiseksi ohjelmoitavat mikronäyte-inkubaattorit suunniteltiin helposti vaihtelemaan lämpötilan muutoksia, jotka ovat optimaaliset kullekin reaktion vaiheelle.

Monistusreaktio voi merkittävästi lisätä analyysin herkkyyttä geenikoetuksen aikana, mikä on erityisen tärkeää tartunnan aiheuttajan alhaisilla pitoisuuksilla.

Yksi monistuksen kanssa tehtävän geenien tutkimisen merkittävistä eduista on mahdollisuus tutkia submikroskooppinen määrä patologista materiaalia.

Toinen menetelmän piirre, joka on tärkeämpi tartuntamateriaalin analysoinnissa, on kyky havaita piilotettuja (hiljaisia) geenejä. Geenikoettamiseen liittyvät menetelmät tulevat varmasti laajemmin mukaan tartuntatautien diagnosointiin niiden yksinkertaistuessa ja halvemmalla.

ELISA- ja RIF-menetelmät ovat enimmäkseen kvalitatiivisia tai puolikvantitatiivisia. Hyvin pienillä komponenttien pitoisuuksilla antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumista ei voida rekisteröidä visuaalisesti tai yksinkertaisin instrumentaalisin keinoin. Antigeenivasta-ainekompleksin osoittaminen tällaisissa tapauksissa voidaan suorittaa, jos jokin alkuperäisistä komponenteista antigeeni tai vasta-aine lisää leiman, joka voidaan helposti havaita määritettävän analyytin pitoisuuteen verrattavissa pitoisuuksissa.

Radioaktiivisia isotooppeja (esim. 125I), fluoresoivia aineita ja entsyymejä voidaan käyttää leimana.

Käytetystä leimasta riippuen on olemassa radioimmuuni- (RIA), fluoresoiva immuuni (FIA), entsyymi-immunomääritys (ELISA) jne. analyysimenetelmiä. ELISA on viime vuosina saanut laajan käytännön sovelluksen, johon liittyy mahdollisuus kvantitatiivisiin määrityksiin. , korkea herkkyys, täsmällisyys ja kirjanpidon automatisointi.

ELISA-analyysimenetelmät ryhmä menetelmiä, jotka mahdollistavat antigeenivasta-ainekompleksin havaitsemisen käyttämällä substraattia, jonka entsyymi pilkkoo värillisen näköisenä.

Menetelmän ydin on antigeenivasta-ainereaktion komponenttien yhdistäminen mitatun entsyymileiman kanssa. Reagoiva antigeeni tai vasta-aine leimataan entsyymillä. Substraatin muuntamisesta entsyymin vaikutuksesta voidaan arvioida vuorovaikutukseen joutuneen antigeeni-vasta-ainereaktiokomponentin määrä. Entsyymi toimii tässä tapauksessa immuunivasteen merkkiaineena ja antaa sinun tarkkailla sitä visuaalisesti tai instrumentaalisesti.

Entsyymit ovat erittäin käteviä leimoja, koska niiden katalyyttisten ominaisuuksien ansiosta ne voivat toimia tehostajina, koska yksi entsyymimolekyyli voi tuottaa enemmän kuin 1 x 105 katalyyttisen tuotemolekyylin minuutissa. On tarpeen valita entsyymi, joka säilyttää katalyyttisen aktiivisuutensa pitkään, ei menetä sitä sitoutuessaan antigeeniin tai vasta-aineeseen ja jolla on korkea spesifisyys substraatin suhteen.

Tärkeimmät menetelmät entsyymillä leimattujen vasta-aineiden tai antigeenien saamiseksi, konjugaatit: kemiallinen, immunologinen ja geenitekniikka. ELISA:ssa käytetään useimmiten entsyymejä: piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, galaktosidaasi jne.

Entsyymin aktiivisuuden havaitsemiseksi antigeeni-vasta-ainekompleksissa reaktion visuaalista ja instrumentaalista rekisteröintiä varten käytetään kromogeenisiä substraatteja, joiden liuokset, aluksi värittömät, saavat värin entsymaattisen reaktion aikana, jonka intensiteetti on on verrannollinen entsyymin määrään. Siten piparjuuriperoksidaasin aktiivisuuden havaitsemiseksi kiinteän faasin ELISA:ssa käytetään substraattina 5-aminosalisyylihappoa, joka antaa voimakkaan ruskean värin, ortofenyleenidiamiinia, joka muodostaa oranssinkeltaisen värin. Alkalisen fosfataasin ja P-galatosidaasin aktiivisuuden havaitsemiseksi käytetään nitrofenyylifosfaatteja ja nitrofenyyligalaktosideja, vastaavasti.

Reaktiotulos värillisen tuotteen muodostumiseen määritetään visuaalisesti tai käyttämällä spektrofotometriä, joka mittaa valon absorptiota tietyllä aallonpituudella.

ELISA-testin toteuttamiseen on monia vaihtoehtoja. On olemassa homogeenisia ja heterogeenisia variantteja.

Asetusmenetelmän mukaan erotetaan kilpailevat ja ei-kilpailevat ELISA-menetelmät. Jos järjestelmässä on ensimmäisessä vaiheessa vain analysoitu yhdiste ja sitä vastaavat sitoutumiskeskukset (antigeeni ja spesifiset vasta-aineet), menetelmä ei ole kilpaileva. Jos analysoitava yhdiste (antigeeni) ja sen analogi (entsyymileimattu antigeeni) ovat läsnä ensimmäisessä vaiheessa kilpailemassa toistensa kanssa sitoutumisesta puutteessa esiintyviin spesifisiin sitoutumiskeskuksiin (vasta-aineisiin), menetelmä on kilpailukykyinen. Tässä tapauksessa mitä enemmän testiantigeeni sisältää liuosta, sitä pienempi on sitoutuneiden leimattujen antigeenien määrä.

fluoresenssivasta-ainemenetelmä (MFA) tai IMMUUNOFLUORESENSSIREAKTIOT (RIF)

Immunofluoresoiva menetelmä on valittu menetelmä tuntemattoman mikro-organismin nopeaan havaitsemiseen ja tunnistamiseen testimateriaalissa.

Ag + AT + elektrolyytti = UV-valokompleksi

Fluorokromilla leimattu mikrobiseerumi

Fluoreseiini-isotiosyanaattiväriä käytetään usein FITC

Tässä tutkimuksessa käytetään fluoresoivaa mikroskooppia.

RIF-lavastus

30 µl FITC-leimattujen vasta-aineiden liuosta levitetään näytteeseen.

Aseta lasi kosteaan kammioon ja inkuboi huoneenlämmössä 20-25 minuuttia tai termostaatissa 37°C:ssa 15 minuuttia.

Huuhtele lasia juoksevalla vesijohtovedellä 2 minuutin ajan, huuhtele tislatulla vedellä ja kuivaa ilmassa.

Kuivattuun siiven päälle levitetään pisara kiinnitysnestettä, sively peitetään peitinlasilla ja mikroskooppoidaan käyttämällä fluoresoivaa mikroskooppia tai fluoresoivaa kiinnitystä tavanomaiseen optiseen mikroskooppiin.

Agglutinaatioreaktio perustuu vasta-aineiden (agglutiniinien) spesifiseen vuorovaikutukseen kokonaisten mikrobi- tai muiden solujen kanssa. Tämän vuorovaikutuksen seurauksena muodostuu hiukkasagglomeraatteja, jotka saostuvat (agglutinoituvat). Bakteerit, alkueläimet, sienet, hiivat, riketsiat, punasolut ja muut solut, sekä elävät että kuolleet, voivat osallistua agglutinaatioreaktioon. Reaktio etenee kahdessa vaiheessa: ensimmäinen on antigeenin ja vasta-aineen spesifinen yhdistelmä, toinen on epäspesifinen, eli näkyvän agglutinaatin muodostuminen. Agglutinaatin saostumista tapahtuu elektrolyyttien, kuten natriumkloridin, läsnä ollessa. Agglutinaatissa olevat mikro-organismit pysyvät elossa, mutta menettävät liikkuvuutensa.

Agglutinaatioreaktiota käytetään laajalti tartuntatautien serologisessa diagnoosissa ja eristettyjen mikrobien antigeenisen rakenteen määrittämisessä. Potilaan tai kantajan kehosta eristetyn patogeenin antigeenisen rakenteen määrittämiseksi käytetään spesifistä immuuniseerumia, joka saadaan immunisoimalla eläimiä (kani, aasi, pässi) tietyillä mikro-organismeilla. Mikrobin tunnistus suoritetaan agglutinaatioreaktiossa lasilla adsorboituneiden tai monoreseptoriseerumien kanssa tai koeputkissa, joissa on spesifisiä agglutinoituvia seerumeita. Adsorboidut seerumit sisältävät vasta-aineita vain tietylle mikrobille spesifisille antigeeneille, ja monoreseptoriseerumit sisältävät vasta-aineita vain yhdelle spesifiselle patogeenin antigeenille.

Lajien seerumit sisältävät vasta-aineita tietyn mikrobin kaikille antigeeneille.

Mikro-organismin eristetyn viljelmän liittyminen tähän lajiin määritetään agglutinaatiolla sen tunnetun seerumin kanssa seerumiampullin etiketissä ilmoitettuun vasta-ainetiitteriin. Seerumin vasta-ainetiitterin katsotaan olevan sen viimeinen laimennos, jossa eläimen immunisointiin käytetyn mikrobiviljelmän agglutinaatiota vielä havaitaan. Adsorboituja ja monoreseptoriseerumeja käytetään yleensä laimentamattomina lasin agglutinaatioreaktiossa.

Kun määritetään vasta-aineiden esiintyminen potilaan veren seerumissa, se laimennetaan isotonisella natriumkloridiliuoksella alkaen laimennuksesta 1:50 - 1:800 tai enemmän. Jokaiseen laimennokseen lisätään elävien tai tapettujen mikrobien suspensio. Lämmöllä tai formaliinilla tapettuja mikrobeja sisältäviä valmisteita kutsutaan diagnosoiksi. Mikro-organismiviljelmiä kuumentamalla saadut diagnoosit sisältävät vain somaattisia antigeenejä. Kun käytetään vain formaliinia, myös siimaantigeenit säilyvät mikrobeissa.

Kun potilaan veressä on vasta-aineita, reaktiossa otettu diagnostiikka tarttuu yhteen ja sakka (agglutinaatti) muodostuu kahdeksi koeputkeksi. Tässä tapauksessa agglutinaatioreaktion tuloksia pidetään positiivisina. Kontrolliputkessa, johon lisätään isotonista natriumkloridiliuosta ja diagnostiikkaa, mikrobisuspension tulee olla homogeeninen (negatiivinen agglutinaatioreaktio).

Agglutinaatioreaktion tulosten huomioiminen joissakin sairauksissa, kuten leptospiroosissa, suoritetaan vain mikroskooppisesti mikroskoopin pimeässä näkökentässä (mikroagglutinaatio). Taudin serologisen diagnoosin tekemiseksi diagnostinen sairaus otetaan huomioon. Se vastaa yleensä seerumilaimennoitetta 1:100 tai 1:200.

Potilaan veren seerumissa agglutinaatioreaktiota käyttämällä voidaan havaita vasta-aineita lavantauti- ja paratyfoidikuumeessa (Vidal-reaktio), luomistaudissa (Wright-reaktio), tularemiassa jne.
Castellanin reaktio. Joillakin tartuntataudeilla tai immunisoinnilla mikro-organismeilla, joiden koostumuksessa on ryhmäantigeenejä, tämän tyypin spesifisten vasta-aineiden lisäksi veren seerumissa esiintyy myös ryhmävasta-aineita. Tässä tapauksessa syntyneet seerumit agglutinoituvat sukulaisbakteerilajeihin.

Castellani ehdotti menetelmää ryhmävasta-aineiden adsorptioon immuuniseerumeista, joka perustuu niiden poistamiseen sukulaislajien mikro-organismien avulla, joilla on ryhmäantigeenejä, mutta joista puuttuu spesifisiä. Tällaisten mikro-organismien viljelmä, lisättynä seerumiin, adsorboi epäspesifisten ryhmien vasta-aineita, ja antigeeni-vasta-ainekompleksin poistamisen jälkeen sentrifugoimalla vain spesifiset immunoglobuliinit jäävät seerumiin. Castellanin menetelmällä käsiteltyjä seerumeja voidaan käyttää agglutinaatioreaktiossa erittäin spesifisinä.

Kohde: Hallita agglutinaatioreaktion ja saostumisreaktion vaiheistustekniikka infektiotautien diagnosoimiseksi.

Moduuli 1 Mikro-organismien morfologia ja fysiologia. Infektio. Immuniteetti.

Aihe 16: Agglutinaatioreaktio. saostumisreaktio.

Aiheen relevanssi. Alla immuniteetti tarkoittaa kehon immuniteettia tartunta- ja ei-tartunnan aiheuttajia (patogeenisiä mikro-organismeja, vieraita proteiineja ja muita aineita) vastaan. Näitä aineita kutsutaan antigeeneiksi. Immuniteetti on joko synnynnäistä tai hankittua. Synnynnäinen- kun muodostuu kudoksia ja humoraalisia suojalaitteita, jotka aiheuttavat immuniteetin tartuntataudeille, jotka ovat periytyviä.

Hankittu- elimistön immuunijärjestelmä suorittaa sen vasta-aineiden tuotannon tai herkistyneiden lymfosyyttien kerääntymisen muodossa. Se on jaettu luonnollinen ja keinotekoinen. Toimintamekanismin mukaan se jaetaan aktiivinen ja passiivinen. Kaikissa immunologisissa reaktioissa pääkomponentti on antigeeni.

Immuunijärjestelmän päätehtävä, joka koostuu imusolmukkeesta, on vieraiden aineiden (antigeenien) tunnistaminen ja niiden neutralointi.

Antigeenit voivat päästä kehoon hengitysteiden, ruoansulatuskanavan, ihon ja limakalvojen kautta. Jokainen antigeeni stimuloi spesifisten proteiiniaineiden - vasta-aineiden - muodostumista.

Antigeenit jaettu täydellisiin ja huonompiin (hapteeneihin). Täydelliset antigeenit aiheuttaa täydellisen immuunivasteen. Vialliset antigeenit eivät aiheuta itsenäisesti immuunivastetta, mutta joskus saavat tämän kyvyn konjugoituna korkean molekyylipainon proteiinikantaja-aineiden kanssa. Lisäksi on antigeenejä: puolihapteeneja, proantigeenejä, heteroantigeenejä ja isoantigeenejä.

Vasta-aineet ovat ihmisen tai eläimen seerumin immunoglobuliineja. Vasta-aineita muodostuu infektion jälkeen sekä heikennetyillä tai tapetuilla bakteereilla, riketsioilla, viruksilla, toksiineilla ja muilla aineilla tehdyn immunisoinnin seurauksena. Vasta-aineet- Immunoglobuliiniproteiinit luokitellaan kemiallisesti glykoproteiineiksi. Immunoglobuliinit jaetaan rakenteen ja immunobiologisten ominaisuuksien mukaan 5 luokkaa: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normaalit vasta-aineet löytyy ihmisistä ja eläimistä, joita ei ole immunisoitu. Spesifiset vasta-aineet muodostuvat infektion tai immunisaation seurauksena.

Vasta-aineen ja antigeenin välistä reaktiota kutsutaan serologinen. Serologiset reaktiot ovat erittäin spesifisiä ja niitä käytetään monien tartuntatautien diagnosoinnissa. On olemassa agglutinaatio- ja saostumisreaktioita.

1. Agglutinaatioreaktio (RA) perustuu antigeenin (agglutinogeeni) ja vasta-aineen (agglutiniini) vuorovaikutukseen, jossa tapahtuu agglutinaatiota ja mikrobikappaleiden saostumista elektrolyytin läsnä ollessa. Agglutinaatioreaktion formulaatiossa on useita muunnelmia.

Tärkeimmät ovat:

- Makroskooppinen (sijoitettu) agglutinaatio koeputkissa. Mikrobisuspensio (diagnosticum) lisätään potilaan seerumiin ja 1 tunnin termostaatissa 37 asteen lämpötilassa olon jälkeen kirjataan seerumin laimennus (tiitteri), jossa reaktio tapahtui. Agglutinaatioreaktion katsotaan olevan positiivinen, kun putken pohjalle muodostuu sakka, jossa supernatantti kirkastuu selvästi. Tätä sakkaa kutsutaan agglutinaatiksi.

Agglutinaatin luonteen mukaan erotetaan hienorakeinen (O) ja karkearakeinen (H) agglutinaatio. Hienojakoisen agglutinaatin havaitsemiseen käytetään agglutinoskooppia. Tulosten laskeminen alkaa ohjausputkista. Seerumin viimeistä laimennusta, jossa havaitaan agglutinaatiota, pidetään sen tiitterinä.

Reaktion tarkoitus: vasta-aineiden havaitseminen potilaan seerumista.

- mikroskooppinen (kiihdytetty) ) likimääräinen agglutinaatio lasilla. Tippa bakteeriviljelmää lisätään pisaralle diagnostista immuuniseerumia ja sekoitetaan tasaisesti. Reaktio etenee huoneenlämpötilassa 5-10 minuutin kuluttua. Sitten tili tehdään. Positiivisella reaktiolla seerumipisarassa havaitaan bakteerien kerääntymistä jyvien tai hiutaleiden muodossa. Reaktion tarkoitus: määrittää patogeenin tyyppi tunnetun diagnostisen seerumin perusteella.

- Epäsuoran (passiivisen) hemagglutinaation (RNGA) reaktio. Tämän reaktion ydin on se, että pässin erytrosyytit pystyvät adsorboimaan antigeenejä pinnalle. Spesifisten vasta-aineiden vaikutuksesta punasolut tarttuvat yhteen ja saostuvat muodostaen hemagglutinaattia pohjaan. Reaktio on erittäin herkkä ja spesifinen. RNGA:n avulla voit havaita vähimmäismäärän polysakkaridityyppisiä vasta-aineita ja viallisia antigeenejä. Tätä reaktiota käytetään monien tartuntatautien (lavantauti ja lavantauti, sivutauti, tuberkuloosi jne.) diagnosoinnissa.

2. Saostusreaktio (RP ) – antigeeni-vasta-ainekompleksin saostaminen. Suurin ero RP:n ja RA:n välillä on, että RA:ssa käytetään korpuskulaarista antigeeniä, kun taas RP:ssä antigeeni on proteiini- tai polysakkaridiluonteinen kolloidinen aine. Tässä reaktiossa antigeeniä kutsutaan saostusgeeniksi ja vasta-aineita kutsutaan saostumaksi. Reaktio pannaan koeputkiin kerrostamalla antigeeniliuos immuuniseerumin päälle. Antigeenin ja vasta-aineiden optimaalinen suhde rajalla

nämä liuokset muodostavat sakkarenkaan. Jos antigeeninä käytetään keitettyjä ja suodatettuja elinten ja kudosten uutteita, reaktiota kutsutaan lämpösaostumisreaktioksi (Ascoli-reaktio, jota käytetään pernaruton, ruton, tularemian jne. diagnosoinnissa).

Saostumisreaktioita agarissa käytetään laajalti: yksinkertainen diffuusiomenetelmä, kaksoisdiffuusiomenetelmä.

Eräs sadetyyppi on flokkulaatioreaktio- toksoidin tai antitoksisen seerumin aktiivisuuden määrittämiseen. Lisäksi tätä reaktiota voidaan käyttää määrittämään Corynebacterium diphtheriae -kantojen toksisuus.

Erityiset tavoitteet:

· Selitä antigeenien rooli immuunivasteen indusoijina;

· Kuvaile antigeenien rakennetta, mukaan lukien mikro-organismien antigeenit;

· Kuvaa agglutinaatioreaktion mekanismi;

· Kuvaile saostumisreaktion mekanismia.

Pystyä:

· Selitä antigeenien rooli immuunivasteen indusoijina;

Kuvaile vasta-aineiden rakennetta (eri immunoglobuliiniluokat);

· Analysoida vasta-aineiden ja antigeenien vuorovaikutusmekanismia;

· Tulkitse agglutinaatioreaktion tulokset;

· Tulkitse saostumisreaktion tulokset;

· Analysoi tulokset.

Teoreettiset kysymykset:

1. Käsitteiden "antigeenit" ja "vasta-aineet" määritelmä.

2. Antigeenien rooli immuunivasteen indusoijina.

3. Vasta-aineiden rakenne (eri immunoglobuliiniluokat).

4. Vasta-aineiden ja antigeenien vuorovaikutuksen mekanismi.

5. Immuunijärjestelmän reaktiot, niiden rooli immuunivasteessa ja tartuntatautien diagnosoinnissa.

6. Agglutinaatioreaktion mekanismi.

7. Saostumisreaktion mekanismi.

Käytännön tehtävät, jotka suoritetaan luokkahuoneessa:

1. Agglutinaatioreaktion määrittäminen vasta-aineiden havaitsemiseksi potilaan seerumista.

2. Mikroagglutinaatioreaktion asettaminen lasille diagnostisilla seerumeilla puhtaan bakteeriviljelmän tunnistamiseksi.

3. Agglutinaatioreaktion tulosten arviointi.

4. Saostusreaktion asettaminen bakteeriantigeenin havaitsemiseksi.

5. Saostusreaktion tulosten arviointi.

6. Epäsuoran hemagglutinaation reaktion tulosten arviointi.

7. Protokollan rekisteröinti.

Kirjallisuus:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologia virologian ja immunologian kanssa - Kiova: Higher School, 1992.- 431s.

2. Vorobjov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Microbiology.- M.: Medicine, 1998.- 336s.

3. Lääketieteellinen mikrobiologia /Toimittaja V.P. Pokrovsky. - M .: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Lääketieteellinen mikrobiologia, immunologia ja virologia / Oppikirja lääketieteellisille yliopistoille, Pietari: "Erikoiskirjallisuus", 1998.- 592s.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologia / Oppikirja - 2. painos, tarkistettu. ja lisää - M .: Lääketiede, 1983.- 512s.

6. Luentomuistiinpanot.

Lisäkirjallisuutta:

1. Titov M.V. Tartuntataudit - K., 1995. - 321s.

2. Shuvalova E.P. Tartuntataudit. - M .: Lääketiede, 1990. - 559s.

Agglutinaatioreaktio.

Agglutinaatioreaktio on mikrobien tai muiden solujen (erytrosyyttien) tarttumista ja saostumista vasta-aineiden vaikutuksesta elektrolyytin läsnä ollessa. Reaktion (agglutinaatioilmiön) näkyvä vaikutus on saostuman muodostuminen, jota kutsutaan agglutinaatiksi.

Tätä reaktiota käytetään serodiagnoosi Ja seridentifiointi. RA:ta käytetään serodiagnoosissa (vasta-aineiden havaitseminen potilaiden veriseerumissa) lavantauti ja sivutauti(Vidal reaktio), luomistauti(Wrightin reaktio) tularemia ja leptospiroosi. RA:ta käytetään seridentifiointiin (potilaasta eristetyn patogeenin tyypin määrittämiseen), kun suolistotulehdus, hinkuyskä, kolera jne.

Komponentitreaktiot:

1. A antigeeni (agglutinogeeni) - nämä ovat kokonaisia ​​(ei tuhoutuneita) mikrobi- tai muita soluja ( corpuscular, liukenematon antigeeni). Agglutinogeenit- Se on jousitus elossa tai tapettu mikrobisoluja tai muita soluja. Antigeenit voivat olla joko tuntemattomia tai tunnettuja. Tuntematon agglutinogeeni on potilaan kehosta eristetty mikrobiviljelmä, joka on määritettävä. tunnettu antigeeni. diagnostinen- diagnostinen lääke - kuolleiden jäädyttäminen mikrobit tunnetut lajit fysiologisessa ratkaisussa. Tämä jousitus samea (läpinäkymätön)), koska mikrobisolut eivät liukene, vaan pysyvät ehjinä. Tunnettua agglutinogeenia käytetään tuntemattomien vasta-aineiden havaitsemiseen potilaan seerumista.

2. Vasta-aine (agglutiniini)- löytyy veriseerumista. Vasta-aineet voivat myös olla joko tuntemattomia tai tunnettuja. Tuntemattomia määritettäviä vasta-aineita löytyy veriseerumista sairas henkilö. Tunnettuja vasta-aineita löytyy immuunijärjestelmän diagnostiset seerumit, joita kutsutaan agglutinoivia seerumeja. Niitä käytetään seroidentifiointiin, ts. tuntemattoman antigeenin määrittäminen - eräänlainen mikrobiviljelmä.

3. Elektrolyytti- 0,9 % natriumkloridiliuos.

RA:n asettamistavat.

1. Likimääräinen (levy) RA- suoritetaan lasille. Levitä 2 tippaa seerumia ja 1 tippa isotonista liuosta lasilevylle. Mikrobiviljelmä viedään yhteen seerumipisaroista ja pisarasta isotonista liuosta silmukalla ja sekoitetaan. Pisara isotonista liuosta bakteerien kanssa – antigeenin valvonta, tippa bakteerittomat seerumit – vasta-aineiden valvonta, tippa seerumi mikrobeilla – kokea. Jos seerumissa on siihen sekoitettuja mikrobiantigeenejä vastaavia vasta-aineita, vasta-aineet ja antigeenit sitoutuvat spesifisesti toisiinsa ja 1-3 minuutin kuluttua koepisarassa ilmaantuu agglutinaattihiutaleita. Antigeenikontrollin tulee olla samea ja vasta-ainekontrollin tulee olla kirkas. Reaktion tulosten huomioiminen suoritetaan agglutinaattihiutaleiden ilmaantumisen perusteella . Jos hiutaleita putoaa, reaktio on positiivinen, ts. antigeeni vastaa vasta-ainetta, ja antigeeniä voidaan käyttää vasta-aineen tunnistamiseen tai päinvastoin. Jos sameus säilyy, reaktio on negatiivinen.

2. Laajentunut agglutinaatioreaktio - suoritetaan koeputkissa. Ensin valmistetaan kaksinkertaiset laimennokset sairaan henkilön veriseerumista 1:50 - 1:1600. 1 ml isotonista natriumkloridiliuosta kaadetaan 6 koeputkeen. Ensimmäiseen koeputkeen lisätään 1 ml potilaan veriseerumia laimennettuna 1:50, sekoitetaan ja saadaan laimennus 1:100, sitten siirretään 1 ml 1:100 laimennusta toiseen koeputkeen. ja saadaan laimennus 1:200 jne. Kaksi koeputkea jätetään kontrolloimaan antigeeniä ja seerumia. Vain 1:50 laimennettu seerumi lisätään seerumikontrolliin, vain antigeeni lisätään antigeenikontrolliin. Kaikkiin muihin putkiin lisätään 0,1 ml antigeenidiagnostiikkaa (O- tai H-) ja kaikki putket asetetaan termostaattiin 37 °C:ssa 18-20 tunniksi. Reaktion tulosten huomioon ottaminen tapahtuu luonteen, muodostuneen sakan (agglutinaatin) määrän ja sameusasteen mukaan. Laskenta suoritetaan vain seuraavilla tuloksilla kontrolleissa: seerumikontrolli - läpinäkyvä, antigeenikontrolli - samea. O-vasta-aineet antavat hienojakoisen sakan. H-vasta-aineet - karkearakeita. Aseta viimeisen koeputken mukaan, jossa agglutinaatioreaktio on vielä näkyvissä diagnostinen tiitteri.

Sairauksien serodiagnosoinnin yhteydessä on tärkeää paitsi havaita spesifiset vasta-aineet tietylle taudinaiheuttajalle, myös tunnistaa niiden lukumäärä, ts. Sellaisen vasta-ainetiitterin määrittämiseksi, kun voimme puhua tämän taudinaiheuttajan aiheuttamasta taudista. Tätä tiitteriä kutsutaan diagnostiseksi tiitteriksi. Esimerkiksi lavantautien diagnosoimiseksi on tarpeen havaita vasta-ainetiitteri 1:400, mutta ei vähemmän. Vielä tarkempia tuloksia saadaan havaitsemalla vasta-aineiden lisääntyminen paritetuissa seerumeissa.Potilaan seerumi otetaan taudin alkaessa ja 3-5 tai useamman päivän kuluttua. Jos vasta-ainetiitteri nousee vähintään 4 kertaa, voimme puhua nykyisestä sairaudesta.

Agglutinaatioreaktio (RA) on mikrobien tai muiden solujen tarttumista ja saostumista vasta-aineiden vaikutuksesta elektrolyytin läsnä ollessa. Syntynyttä sakkaa kutsutaan agglutinaatiksi.

RA:ta käytetään:

1. Vasta-aineiden havaitseminen potilaan veriseerumista (serodiagnoosi).

2. Määrittää potilaasta eristettyjen patogeenisten mikro-organismien puhdasviljelmän tyyppi ja serovari (serotyyppi).

Agglutinaatioreaktiota käytetään vasta-aineiden määrittämiseen veren seerumissa potilailla, joilla on esimerkiksi lavantauti ja paratyfoidi (Vidal-reaktio), luomistauti (Wright-, Huddleson-reaktiot), tularemia, leptospiroosi ja muut tartuntataudit. potilaasta eristetty taudinaiheuttaja (suolitulehdus, hinkuyskä jne.). RA:ta käytetään veriryhmien, Rh-tekijän jne. määrittämiseen.

Reaktio vaatii seuraavat komponentit:

1. Antigeenin (agglutinogeenin) on oltava korpuskulaarinen, eli se on elävien tai kuolleiden mikro-organismien (diagnoosi m), punasolujen tai muiden solujen suspensio. Yleensä käytetään päivittäistä mikro-organismiviljelmää, jota kasvatetaan agar-vinopinnalla. Viljelmä pestään pois 3-4 ml:lla isotonista liuosta, siirretään steriiliin koeputkeen ja määritetään tiheys. Suspension tulee olla homogeeninen ja sisältää enintään 3 miljardia mikrobisolua 1 ml:ssa. Tapattujen mikrobien suspension - diagnostiikan - käyttö helpottaa työtä (valmistellaan tehtaalla).

2. Vasta-aineita (agglutiniinit) löytyy potilaan seerumista (serodiagnoosin yhteydessä) tai agglutinoivasta seerumista (serotyypityksen yhteydessä). Agglutinoituvia seerumeita saadaan immunisoimalla kaneja tapetuilla bakteereilla.

Titteri agglutinoiva seerumia kutsutaan sen suurimmaksi laimennokseksi, jossa se ei reagoi vastaavan antigeenin kanssa tietyissä koeolosuhteissa.

Agglutinoituvat seerumit voivat olla luontaisia ​​(adsorboimattomia) ja adsorboituja. Natiivit seerumit pienissä laimennoksissa eivät ole vuorovaikutuksessa vain niiden mikro-organismien kanssa, joilla eläin immunisoitiin seerumin saamiseksi, vaan myös samantyyppisten mikro-organismien kanssa, koska ne sisältävät ryhmävasta-aineita (vasta-aineita mikro-organismeille, joilla on yhteisiä antigeenejä). Natiivisia seerumeita käytetään pidennetyssä agglutinaatioreaktiossa (serodiagnoosin kanssa), joka ottaa huomioon reaktion läsnäolon lisäksi myös vasta-ainetiitterin nousun dynamiikan.

Jos ryhmävasta-aineita uutetaan (adsorboidaan) luonnollisesta seerumista vuorovaikutuksella sukulaisten bakteerien kanssa, joilla on ryhmäantigeenejä, saadaan adsorboituja seerumeja. Adsorboituneet seerumit voivat olla monoreseptorispesifisiä (tai tyyppispesifisiä), jotka sisältävät vasta-aineita vain yhdelle antigeenireseptorille Moniarvoiset seerumit koostuvat useiden adsorboituneiden tai adsorboitumattomien seerumien seoksesta. Adsorboituja seerumeita käytetään lasin agglutinaatioreaktioon.

Kun eläimiä immunisoidaan liikkuvilla bakteereilla H-antigeenillä, saadaan H-vasta-aineita sisältäviä H-agglutinoivia seerumeita (esimerkiksi Salmonellan monoreseptorin H-agglutinoiva seerumi). O-antigeeni-immunisaatio tuottaa O-agglutinoivia seerumeita, jotka sisältävät O-vasta-aineita (esimerkiksi salmonellaryhmään adsorboitua O-agglutinoivaa seerumia, anti-koleraa O-agglutinoivaa seerumia). Immunisointi H- ja O-antigeeneillä tuottaa seerumeita, joissa on H- ja O-vasta-aineita.

Lisäksi O-agglutiniinit antavat hienojakoisen agglutinaattien ja H-agglutiniinit karkearakeisen sakan.

3. Elektrolyytti - isotoninen NaCl-liuos (0,9 % natriumkloridiliuos, valmistettu tislatulla vedellä).

Agglutinaatioreaktion aikaansaamiseksi on kaksi päämenetelmää: reaktio lasilla (joskus kutsutaan indikatiiviseksi tai lamelliseksi) ja laajennettu reaktio (koeputkissa)

Lasin agglutinaatioreaktion lausunto. Kaksi tippaa seerumia ja tippa isotonista natriumkloridiliuosta levitetään rasvattomalle lasilevylle. Diagnostinen agglutinoiva seerumi otetaan yhdessä laimennuksessa, joka tiitterin mukaan on 1:10, 1:25, 1:50 tai 1:100. Yhteen seerumipisaroista ja isotonisen liuoksen pisaroista viedään tutkittavan mikro-organismin viljelmä silmukalla ja sekoitetaan huolellisesti. Pisara natriumkloridia mikro-organismien kanssa on antigeenikontrolli, pisara seerumia ilman mikro-organismeja on seerumikontrolli. Älä siirrä viljelmää seerumipisarasta NaCl-tippaan. Reaktio etenee huoneenlämpötilassa 1-3 minuuttia. Jos seerumikontrolli pysyy kirkkaana, antigeenikontrollissa havaitaan tasaista sameutta ja agglutinaattihiutaleita ilmaantuu pisaraan, jossa viljelmä sekoitetaan seerumin kanssa, niin tulosta pidetään positiivisena. Jos pisarassa on tasainen sameus seerumin ja antigeenin kanssa, tämä on negatiivinen tulos. Reaktio näkyy selkeämmin tummalla taustalla.

Seerumi

1. antigeenikontrolli

2. seerumin kontrolli