Yhdistelmä-DNA:n ja RNA:n toimittaminen soluun. rdna biotekniikka

Kaikki menetelmät GMO:ien saamiseksi on jaettu suoriin (vektoriton) ja epäsuoriin (vektori).

Kaikilla suorilla menetelmillä siirtogeenisten eläinten saamiseksi on useita olennaisia puutteita: työläisyys, kalliiden laitteiden ja reagenssien käyttö, usein DNA-molekyylien satunnainen liittäminen transformoituneiden eläinten solujen genomiin, suuri määrä soluja kuolee transformaation jälkeen, mosaiikkiisuus siirretyn siirtogeenin mukaan.

Merkittävä etu Suorien menetelmien käyttö on melko korkea tehokkuus vieraan DNA:n siirtämisessä, eli siirtogeeni on mahdollista siirtää suurempaan määrään soluja kuin epäsuorilla menetelmillä.

Vaatimukset vektori-DNA:lle, sen koostumus

Vektori on DNA- tai RNA-molekyyli, joka koostuu kahdesta komponentista: vektoriosa(kantaja) ja kloonattu vieras geeni. Vektorin tehtävänä on toimittaa valittu DNA vastaanottajasoluun, integroida se genomiin, mahdollistaa transformoituneiden solujen tunnistaminen ja varmistaa siirretyn geenin vakaa ekspressio.

Siten vektorin on oltava pieni, sitä voidaan pitää isäntäsolussa (replikoitua), moninkertaistaa (amplifioida), ekspressoida sopivaa geeniä (sisältää asianmukaiset säätelysekvenssit), siinä on oltava markkerigeeni, jonka avulla voidaan erottaa hybridi. solut niiden tehokkaaseen valintaan; on voitava siirtyä vastaavan organismin soluun.

Yhdessä kiinnostavan geenin kanssa vastaanottajasolu injektoidaan markkerigeenit välttämätön organismin siirtogeenisyyden määrittämiseksi.

On mahdollista erottaa 2 markkerigeenien ryhmää, jotka mahdollistavat transformoituneiden solujen erottamisen:

• 1. Selektiiviset geenit, jotka vastaavat resistenssistä antibiooteille (kanamysiini, tetrasykliini, neomysiini jne.), rikkakasvien torjunta-aineille (kasveissa). Nämä voivat olla auksotrofian geenejä jollekin substraatille jne. Tällaisen markkerin toimintaperiaate on transformoituneiden solujen kyky kasvaa selektiivisellä ravintoalustalla, johon on lisätty tiettyjä aineita, jotka estävät transformoitumattomien, normaalien solujen kasvua ja jakautumista.
• 2. Reportterigeenit, jotka koodaavat soluille neutraaleja proteiineja, joiden esiintyminen kudoksissa on helposti testattavissa.

Yleisimmin käytetyt reportterigeenit ovat β-glukuronidaasi (GUS), vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), lusiferaasi (LUC) ja kl(CAT) geenit. GUS- ja GFP-geenit sekä vähemmässä määrin LUC- ja CAT-geenit ovat yleisimmin käytettyjä tästä arsenaalista. Tällä hetkellä reportterigeeninä käytetty GUS on modifioitu geeni Escherichia colista, joka koodaa p-glukuronidaasia, jonka molekyylipaino on 68 kD. GUS on aktiivinen monenlaisissa ympäristöolosuhteissa optimaalisella pH-arvolla 5-8 ja 37 °C:ssa. Se voi hydrolysoida monenlaisia ​​luonnollisia ja synteettisiä glukuronideja, mikä mahdollistaa sopivien substraattien valinnan entsyymiaktiivisuuden spektrofotometriseen tai fluorometriseen määritykseen sekä kudosten in situ histokemialliseen värjäykseen (esimerkiksi sinisellä). Entsyymi on melko vakaa: se kestää lämpöä (puoliintumisaika 55 °C:ssa noin 2 tuntia) ja pesuaineiden vaikutusta. GUS-aktiivisuus ei häviä jäädytys-sulatusprosessin aikana. Osana geneettisesti muokattuja kimeerisiä proteiineja GUS säilyttää yleensä toiminnallisen aktiivisuutensa. Elävissä soluissa GUS-proteiini on myös erittäin stabiili ja aktiivinen useista tunteista useisiin päiviin.

GFP:n (vihreä fluoresoiva proteiini) löysivät Shimomura et ai. vuonna 1962 luminesoivassa meduusassa Aequorea victoria. GFP-geenin kloonasivat vuonna 1992 Prasher et al., ja jo muutama vuosi myöhemmin tätä geeniä käytettiin aktiivisesti reportterigeeninä tutkimuksissa erilaisilla pro- ja eukaryoottisilla organismeilla. Tällä hetkellä GFP-geeniä käytetään sadoissa tutkimuksissa maailmanlaajuisesti, ja niiden määrä kasvaa nopeasti. Tällainen nopea kasvu johtuu GFP-proteiinin erityisominaisuuksista, nimittäin sen kyvystä fluoresoida spektrin näkyvällä (vihreällä) alueella, kun sitä säteilytetään pitkäaaltoisella UV-säteilyllä. Tämä fluoresenssi johtuu suoraan proteiinista, eikä se vaadi substraatteja tai kofaktoreita ilmenemään. Tästä ominaisuudesta johtuen GFP-geeni on erittäin lupaava reportterigeeni, jonka avulla voidaan suorittaa erilaisia ​​in vivo (-tuhoamattomia) tutkimuksia siirtogeenisillä organismeilla.

Merestä anemone Discosoma sp. Äskettäin on eristetty toinen punaisena fluoresoiva DsRed-proteiini. Venäjän tiedeakatemian tutkijat ovat äskettäin eristäneet useita samanlaisia ​​fluoresoivia proteiineja erilaisista Anthozoa-lahkon korallipolyypeistä. Se voidaan denaturoida erittäin korkeilla lämpötiloilla, äärimmäisillä pH-arvoilla tai vahvoilla pelkistysaineilla, kuten Na2SO4. Palattuaan fysiologisiin olosuhteisiin GFP palauttaa suurelta osin kyvyn fluoresoida. GFP säilyttää yleensä toiminnallisen aktiivisuutensa osana geenitekniikan menetelmillä luotuja kimeerisiä proteiineja. Elävissä soluissa GFP-proteiini on myös erittäin stabiili.

CAT-geenit ovat vastuussa klosynteesistä (eristetty Escherihia colista). Tämä entsyymi katalysoi asetyyliryhmän siirtymistä asetyyli-CoA:sta kloramfenikoliin. Se määritetään histokemiallisesti muuttamalla kudoksen väriä, kun sopiva substraatti lisätään.

Lukuisat tutkimukset osoittavat, että erilaisten virusten käyttö on erittäin tehokas ratkaisu, jonka avulla voit päästä läpi kehon immuunipuolustuksen ja infektoi sitten solut käyttämällä niitä viruksen levittämiseen. Tämän toimenpiteen suorittamiseksi geeniteknikot valitsivat sopivimmat virukset retrovirusten ja adenovirusten ryhmästä. Retrovirukset tuovat geneettistä tietoa ribonukleiinihapon (RNA) muodossa, DNA:n kaltaisena molekyylinä, joka auttaa käsittelemään DNA:han tallennettua geneettistä tietoa. Heti kun on mahdollista tunkeutua syvälle niin kutsuttuun kohdesoluun, RNA-molekyylistä saadaan kopio DNA-molekyylistä. Tätä prosessia kutsutaan käänteistranskriptioksi. Kun uusi DNA-molekyyli on kiinnitetty soluun, kaikki solun uudet kopiot sisältävät kyseisen muunnetun geenin.

Adenovirukset kuljettavat geneettistä tietoa välittömästi DNA:n muodossa, joka toimitetaan jakautumattomaan soluun. Siitä huolimatta nämä virukset toimittavat DNA:ta suoraan kohdesolun tumaan DNA ei sovi solun genomiin. Siten muunneltu geeni ja geneettinen informaatio eivät siirry tytärsoluihin. Adenoviruksilla suoritettavan geeniterapian etuna on, että geenejä on mahdollista viedä hermoston soluihin ja hengitysteiden limakalvoille, jälleen vektorin avulla. Lisäksi on olemassa kolmas geeniterapiamenetelmä, joka suoritetaan niin kutsuttujen adeno-assosioituneiden virusten kautta. Nämä virukset sisältävät suhteellisen pieni määrä geneettistä tietoa, ja niitä on paljon vaikeampi eliminoida kuin retrovirukset ja adenovirukset. Adeno-assosioituneiden virusten etuna on kuitenkin se, että ne eivät aiheuta ihmisen immuunijärjestelmän reaktiota.

Antropogenetiikan genealoginen menetelmä

Tämän menetelmän perustana on sukutaulujen kokoaminen ja analysointi. Tätä menetelmää on käytetty laajalti muinaisista ajoista nykypäivään hevoskasvatuksessa, arvokkaiden nautaeläinten ja sikojen valinnassa, puhdasrotuisten koirien hankinnassa sekä uusien turkiseläinrotujen jalostuksessa.

Ihmisgenetiikan tutkimusmenetelmänä sukututkimusmenetelmää alettiin käyttää vasta 1900-luvun alusta, jolloin kävi selväksi, että sukutaulujen analyysi, jossa jonkin ominaisuuden (taudin) siirtyminen sukupolvelta toiselle voidaan korvata. hybridologisella menetelmällä, jota ei itse asiassa voida soveltaa ihmisiin.

Sukutauluja koottaessa lähteenä on henkilö - proband, jonka sukutaulua tutkitaan. Yleensä tämä on joko potilas tai tietyn piirteen kantaja, jonka periytymistä on tutkittava. Sukutaulukoita laadittaessa käytetään G. Yustin vuonna 1931 ehdottamia symboleita (kuva 6.24). Sukupolvet on merkitty roomalaisilla numeroilla, tietyn sukupolven yksilöt on merkitty arabialaisilla numeroilla.

Sukututkimusmenetelmän avulla voidaan määrittää tutkitun piirteen perinnöllinen ehdollisuus sekä sen periytymistyyppi (autosomaalinen dominantti, autosomaalinen resessiivinen, X-sidottu dominantti tai resessiivinen, Y-sidottu). Kun analysoidaan sukutauluja useiden ominaisuuksien osalta, voidaan paljastaa niiden periytymisen linkitys, jota käytetään kromosomikarttoja laadittaessa. Tämän menetelmän avulla voidaan tutkia mutaatioprosessin intensiteettiä, arvioida alleelin ekspressiivisuutta ja penetranssia. Sitä käytetään laajasti lääketieteellisessä geneettisessä neuvonnassa jälkeläisten ennustamiseen. On kuitenkin huomattava, että sukututkimuksesta tulee paljon monimutkaisempaa, kun perheissä on vähän lapsia.

8860 0

Tällä hetkellä tunnetaan noin 40 erilaista menetelmää yhdistelmä-DNA:n kuljettamiseksi soluihin, jotka ratkaisevat plasmamembraanin ylittämisen ongelman eri tavoin. Toistaiseksi ei ole olemassa yhtenäistä luokittelua menetelmille, joilla yhdistelmä-DNA:ta viedään soluihin. Jokainen arvostelujen kirjoittaja luokittelee omalla tavallaan, ehkä siksi, että monille empiirisesti löydetyille menetelmille kalvon voittamisen mekanismi ei ole vieläkään selvä, esimerkiksi transformaatiolle. Myös terminologiaan liittyy epävarmuutta, mikä ei ole yllättävää nopeasti kehittyvälle uudelle tieteen ja käytännön alalle.

Jokaisella menetelmällä vieraan DNA:n kuljettamiseksi soluihin on omat ominaisuutensa, etunsa ja haittansa solujen eloonjäämisen, annon tehokkuuden, monipuolisuuden ja teknisten toteutusmahdollisuuksien suhteen. Menetelmän valinta riippuu isäntäsolujen tyypistä ja käytetyn vektorin tyypistä sekä kokeen tekijän henkilökohtaisista mieltymyksistä ja kyvyistä. Joitakin tunnetuimmista menetelmistä DNA:n kuljettamiseksi kohdesoluihin käsitellään yksityiskohtaisesti alla.

Transformaatio sen yleisimmässä merkityksessä on prosessi, jossa vapaata DNA:ta viedään soluun. Suppeammassa merkityksessä termiä käytetään pääasiassa bakteerien yhteydessä, mikä tarkoittaa yhdistelmä-DNA:n absorptioprosessia pätevien solujen toimesta, jonka aiheuttaa solukalvon lämpötilafaasimuutos. E. coli on yleisin organismi, kun työskennellään yhdistelmä-DNA:n kanssa, ja plasmidi-DNA:n soluihin pääsyn varmistamiseksi soluja pidetään jääkylmässä CaCl2- ja DNA-liuoksessa, minkä jälkeen ne altistetaan lämpösokille 42 °C:ssa. ~1 min.

Ilmeisesti tällaisen hoidon seurauksena tapahtuu paikallista soluseinän tuhoutumista. Transformaatiotehokkuus, joka määritellään transformanttien lukumääränä 1 µg:aa lisättyä DNA:ta kohti,
kun taas se on noin 10000 - 10000000 . Tämän menetelmän tehokkuus on alhainen, noin alle 0,1 % soluista transformoituu, mutta tämä haitta kompensoidaan käyttämällä valintamenetelmiä, joiden avulla voit nopeasti tunnistaa halutut kloonit.

Soluja, jotka pystyvät absorboimaan vierasta DNA:ta, kutsutaan päteviksi. Näiden solujen osuus populaatiosta on yleensä hyvin pieni, mutta sitä voidaan lisätä käyttämällä erityistä ravintoalustaa, viljelyolosuhteita ja kemiallisia kykyä indusoivia aineita (valittu pääsääntöisesti empiirisesti). Usein käytetty vaihe pätevien solujen valmistuksessa on sferoplastien tuotanto - solut osittain tai kokonaan (protoplastit), joista puuttuu ulompi jäykkä soluseinä.

Tämä on esimerkiksi ainoa tapa transformoida tehokkaasti monia grampositiivisia bakteereja suvuista Bacillus, Listeria, Streptommyces jne. Jotkut hiivan transformaatiotekniikat sisältävät myös vaiheet, joissa hiivasolun seinämä poistetaan entsymaattisesti glukosidaasien avulla. Organismit, jotka ovat vastustuskykyisiä kemiallisille indusoijille tai joilla ei ole luonnollista kompetenssia, käytetään muita DNA-kuljetusjärjestelmiä.

Konjugaatio. On olemassa bakteeriplasmideja (konjugatiivisia plasmideja), joilla on kyky luoda solujen välisiä kontakteja, joiden kautta ne kulkevat solusta toiseen. Kontaktien muodostuminen luovuttaja- ja vastaanottajasolujen välillä varmistetaan plasmidien konjugatiivisilla ominaisuuksilla ja itse DNA:n siirtämisellä mobilisaatio-ominaisuudet. Tässä tapauksessa konjugatiivinen plasmidi voi kuljettaa mukanaan tavallista plasmidivektoria, joka sijaitsee samassa solussa.

Siten on mahdollista transformoida vastaanottajasoluja, joita on vaikea transformoida muilla tavoilla. Esimerkiksi laajan isäntäalueen sukkulavektorin pAT187 mobilisoiva siirtyminen E. colista erilaisiin grampositiivisiin bakteereihin (suvut Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus jne.) on osoitettu, vaikkakin paljon heikommin kuin siirrettäessä erilaisten välillä. E. coli -kannat.

Lisäksi äskettäin on osoitettu mahdollisuus DNA:n konjugatiiviseen siirtämiseen bakteerisoluista viljeltyihin eläinsoluihin. Konjugaation aikana luovuttajaplasmidista siirretään vain yksi juoste, jolle sitten syntetisoidaan toinen juoste. Tämä johtaa siihen, että isäntärestriktioentsyymit eivät hyökkää konjugatiivisesti siirrettyyn plasmidiin. Tämän menetelmän tehokkuus bakteereille on verrattavissa transformaatioon.

Virusinfektio. Viruksiin perustuvien vektoreiden tuomiseen käytetään laajasti isäntäsolun luonnollista tartuntareittiä, joka riippuu viruksen tyypistä.

rei'itysmenetelmät. Yksi suosituista menetelmistä nukleiinihappojen viemiseksi kohdesoluihin on elektroporaatio - huokosten tilapäinen luominen lipidikaksoiskalvoon lyhyen sähkökentän altistuksen alaisena. Se on universaali fysikaalinen transformaatiomenetelmä, jonka tekniikka on kehitetty lähes kaikille solutyypeille.

Kun työskennellään E. colin kanssa, valmistettu solususpensio (~50 µl) ja DNA asetetaan elektrodien väliin ja syötetään yksittäinen virtapulssi, jonka kesto on ~4,5 ms jännitteellä 1,8 kV, elektrodien välinen etäisyys on 1 mm. Tällaisen käsittelyn jälkeen transformaatiotehokkuus kasvaa arvoon 109-1011 pienillä plasmideilla (~3-6 kb) ja jopa 106:een suurilla (~135 kb). Samanlaisia ​​olosuhteita käytetään viemään BAC-vektori E. coliin.

Suurjännitepurkauksen elektroporatiivinen vaikutus kaksikerroksiseen lipidikalvoon riippuu ilmeisesti sen kaarevuussäteestä. Siksi pienet bakteerisolut absorboivat DNA:ta tehokkaasti paljon suuremmalla kentänvoimakkuudella (12–18 kV/cm) kuin suuret eläin- ja kasvisolut, jotka absorboivat DNA:ta tehokkaasti kentänvoimakkuudella 1–2 kV/cm. Elektroporaatio on yksinkertaisin, tehokkain ja toistettavin menetelmä DNA-molekyylien viemiseksi soluihin, mikä kuitenkin vaatii erityisen elektroporaattorilaitteen.

Muita rei'itysmenetelmiä DNA:n kuljettamiseksi soluun ovat: solujen käsittely ultraäänellä, solujen kaapiminen substraatista eksogeenisen materiaalin läsnä ollessa, solujen sentrifugointi elatusaineessa DNA:n kanssa yhdessä elektroporaation kanssa, plasmakalvon osmoottinen perforointi, solu koetin lasermikrosäteellä ja huokosia muodostavan streptolysiini-O-toksiinin käyttö.

Transfektio. Aluksi tämä termi tarkoitti virus-DNA:n viemistä soluihin, nyt sen merkitys on laajentunut tarkoittamaan minkä tahansa vieraan DNA:n viemistä eukaryoottisoluihin. Termi "transformaatio", joka tarkoittaa prosessia DNA:n viemiseksi soluun prokaryooteille ja hiivalle, osoittautui epämukavaksi käyttää, koska eläinsolujen suhteen transformaatio on normaalien solujen muuntamista syöpäsoluiksi. Suppeassa merkityksessä transfektio ymmärretään yleensä DNA:n viemiseksi eukaryoottisoluihin käyttämällä erilaisia ​​kemiallisia reagensseja.

Yksi ensimmäisistä tehokkaaseen transfektioon kehitetyistä menetelmistä oli DNA:n inkubaatio DEAE-dekstraanin kanssa. Saatu tehokkuus oli verrattavissa bakteerien transformaatioon ja saavutti 106 transfektanttia per ug DNA:ta.

DEAE-dekstraanin vaikutusmekanismia ei ole täysin selvitetty, mutta tiedetään, että se sitoutuu DNA:han ja solukalvoon stimuloiden pinosytoosia (kuva 2.8), vaikka solut eivät itse ottaisi sitä itseensä. Menetelmän haittoja ovat DEAE-dekstraanin toksisuus joillekin solutyypeille, tehokkuuden riippuvuus valmisteen laadusta ja erittäin alhainen stabiilien transfektanttien saaminen.

Riisi. 2.8. Kaavio DNA:n viemisestä soluun osana erilaisia ​​komplekseja endosytoosilla: fagosytoosi ja pinosytoosi (a). Kaavioesitys hiukkasesta, joka on peräisin ei-lipidipolykationista dendromuodossa, jossa on sitoutunut DNA, jonka negatiivista varausta kompensoi kationinen polymeeri (b)

Muiden transfektioreagenssien etsinnän aikana havaittiin, että polymeerimolekyylit, joissa on ylimääräinen kationinen varaus, voivat merkittävästi lisätä transfektion tehokkuutta. Polymeerikationit muodostavat stabiileja komplekseja neutraloiduilla varauksilla nukleiinihappojen kanssa, jotka voivat kuljettaa DNA:ta ja RNA:ta soluun suurella tehokkuudella suojaten endonukleaasien vaikutukselta matkalla ytimeen (kuva 2.9).

Riisi. 2. 9. Kaavio DNA:n kuljettamisesta solutumaan osana polykationi-DNA-kompleksia, joka liittyy tiettyyn ligandiin ligandivälitteisen endosytoosin kautta

Vallankumous oli ensimmäisen vähän myrkyllisen kationisen lipidin DOTMA (1,2-dioleyyli-3-N,N,N-trimetyyliaminopropaani), jonka ovat syntetisoineet Feigner (Feigner, 1987) et ai. Transfektioteho kationisella lipidillä (kuva 2.10) oli noin 100 kertaa suurempi kuin millään muulla kemikaalilla, ja suuri osa stabiileista siirtogeenisistä soluista oli.

Riisi. Kuva 2. 10. DNA-kompleksin rakenne (a) ja kationisen lipidipolymeerin (b) yleinen rakenne. Kationiset lipidipolymeerit (lineaariset ja haarautuneet), jotka ovat rakenteeltaan ja ominaisuuksiltaan samanlaisia ​​kuin solukalvon fosfolipidit, muodostavat komplekseja DNA:n kanssa monikerroksisten kationisten liposomien muodossa (a) yksinkertaisesti sekoittamalla reagenssit. Tällaiset kompleksit tulevat soluun endosytoosin kautta tai fuusioimalla solukalvoon lipidiosan kautta.

Tämän menestyksen pohjalta on kehitetty lukuisia muunnelmia näistä yhdisteistä (Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin jne.).

Samanaikaisesti kehitettiin DNA:lla tai RNA:lla täytettyihin fosfolipidiliposomeihin perustuvia kuljetusvälineitä.

Keinotekoisten kalvojen pienet pallot voivat fuusioitua solujen plasmakalvojen kanssa tai ne voidaan ottaa endosytoosiin, jolloin sisältö vapautuu soluun. Liposomaalisen transfektion alhaista tehokkuutta lisäsi fosfolipidien tuominen liposomien rakenteeseen, esimerkiksi kardiolipiini ja fosfatidyylietanoliamiini, jotka muodostavat kaksikerroksisten kalvojen ohella myös käänteisiä misellirakenteita eli kuutio- ja kuusikulmaisia ​​faaseja, jotka kykenevät käynnistämään kalvon. fuusio.

Liposomaalinen menetelmä on melko oikukas ja vaatii kaikkien olosuhteiden huolellista valintaa spesifisten solujen tehokkaan transfektion varmistamiseksi. Lisäksi kapselointimenettely, tavallisesti sonikointi, vahingoittaa usein suuria DNA-molekyylejä.

Uusi vaihe transfektioreagenssien kehityksessä on ollut nukleiinihappojen tehokkaamman ja kohdennetumman toimituksen kehittäminen spesifisiin kohdesoluihin tuomalla erilaisia ​​ligandeja synteettisten transfektioreagenssien ja liposomien rakenteeseen sitoutumista varten kalvoreseptoriproteiineihin. Sellaisten solureseptorien tunnistamien kohderyhmien (ligandien) läsnäolo mahdollistaa ligandivälitteisen endosytoosin mekanismien käytön (ks. kuva 2.9).

Tällaisina ligandeja, proteiineja ja peptidejä, jotka reseptorit tunnistavat, käytetään; oligosakkarideja, koska monien eläinsolujen pinnalla on lektiinejä - reseptoriproteiineja, jotka sitovat niitä spesifisesti; polysakkarideja. Vuorovaikutusprosessit tällaisten kohdistettujen DNA(RNA)-transfektioreagenssikompleksien solujen kanssa ovat samanlaisia ​​kuin viruspartikkelien tunkeutuminen soluun.

Tällä hetkellä bioteknologiayritykset tarjoavat laajan valikoiman erilaisia ​​transfektioreagensseja - yksinkertaisimmista ja halvimmista viimeisimpiin kehityksiin, jotka on erikoistuneet erilaisiin solutyyppeihin ja tehtäviin. Myös uusien, entistä tehokkaampien transfektioreagenssien luominen jatkuu intensiivisesti.

Mikroinjektio - solukalvo lävistetään mikroneulalla ja DNA:ta sisältävä liuos ruiskutetaan solun sytoplasmaan tai suoraan tumaan, jos tuma on riittävän suuri (esimerkiksi munan ydin). DNA:n mikroinjektio nisäkässoluihin tuli mahdolliseksi halkaisijaltaan 0,1-0,5 mikronin mikropipettien ja mikromanipulaattorin käyttöönoton myötä. Menetelmä on erittäin tehokas, stabiilisti integroituneiden ja injektoitujen geenien ilmentymisen omaavien solujen osuus voi nousta 50 %:iin. Kuvatun menetelmän etuna on myös se, että se mahdollistaa minkä tahansa DNA:n viemisen mihin tahansa soluun, eikä vaadita selektiivistä painetta lisätyn geenin säilyttämiseksi soluissa.

Ballistinen transfektio, bioballistiikka tai biolistiikka (mikrohiukkaspommitus) perustuu solujen pommitukseen noin 1-2 mikronia kooltaan DNA:lla päällystetyillä mikropalloilla. Käytetään kullan, volframin (joskus fytotoksisen), silikonin ja erilaisten synteettisten nanopallojen mikrohiukkasia. DNA:lla päällystetyt mikropartikkelit kulkevat solukerrosten läpi ja siirtävät geneettisen rakenteen suoraan solujen organelleihin ja ytimiin. Tätä tarkoitusta varten luotu "geenipyssy" (geenipyssy) tai "geenipyssy", jonka J. Sanford kehitti vuonna 1987 viemään DNA:ta viljanjyviin, on rakenteeltaan samanlainen kuin pneumaattiset aseet (kuva 2.11). .

Riisi. 2.11. Yhdistelmä-DNA:n vieminen kasvin lehtiin käyttämällä Bio-Rad uudelleenkäytettävää geenipistoolia (a) ja sen yleistä kaaviota (b). Heliumpulssi poistaa näytekapselista DNA:lla tai RNA:lla päällystettyjä mikrohiukkasia. DNA:ta kantavia mikrohiukkasia kiihdytetään ja fokusoidaan maksimaalisen tunkeutumisen saavuttamiseksi soluihin, liikkuen kiihdytyskanavaa ja aseen piippua pitkin, kun taas leveässä ulostulossa heliumvirtaus hajaantuu hajallaan sivuille. Suodattimen välike säilyttää optimaalisen etäisyyden osuakseen kohteeseen maksimaalisella heliumin poistolla minimoidakseen vaurioittavat vaikutukset solun pintaan.

Tällainen transfektion keinojen ja menetelmien moninaisuus johtuu erilaisista tehtävistä, laajasta kohdesolujen ja soluihin toimitettavien nukleiinihappojen tyypeistä sekä yhteiskunnan tarpeesta saada entistä tehokkaampia keinoja geneettisen tiedon välittämiseksi soluihin. , kudokset ja kokonaiset organismit. Erityistä huomiota kiinnitetään transfektioreagenssien ja -menetelmien kehittämiseen liittyen ihmisen geeniterapian silmiinpistävään tulevaisuuteen, mikä edellyttää kohdistettuja, erittäin tehokkaita ja turvallisia geeninkuljetusvälineitä.

Vieraan DNA:n stabiili ja ohimenevä vieminen soluun. Sen jälkeen kun yhdistelmä-DNA:ta on viety eukaryoottisoluun, vain pieni osa siitä päätyy tumaan, koska tumakalvo on valtava este vieraalle DNA:lle. Ytimessä yhdistelmä-DNA voi integroitua kromosomiin tai olla jonkin aikaa kromosomin ulkopuolisessa tilassa.

Sen mukaisesti erotetaan stabiili transfektio, jossa yhdistelmä-DNA integroituu vastaanottajasolujen kromosomeihin ja tulee niiden kiinteäksi osaksi, sekä tilapäinen tai ohimenevä transfektio, jossa yhdistelmä-DNA-molekyylejä esiintyy ja ne transkriptoidaan ytimiin kromosomin ulkopuolisessa solussa. tila lyhyeksi ajaksi. Siirretyn vieraan DNA:n vakaa periytyminen on pääedellytys siirtogeenisten organismien saamiseksi taloudellisiin tarkoituksiin.

Siksi erityistä huomiota kiinnitetään menetelmien kehittämiseen DNA:n viemiseksi soluihin, mikä johtaa suuremman osuuden stabiilien transformanttien tuotantoon. Lisäksi suuri prosenttiosuus stabiileista transformanteista mahdollistaa myös selektiivisten ja markkerigeenien hylkäämisen, jotka ovat painolastina siirtogeenisten organismien luomisessa.

PÄÄLLÄ. Voinov, T.G. Volova

Rekombinantti-DNA viedään vastaanottajasoluihin. Geenitekniikassa tällaisilla vastaanottajasoluilla on kaksi roolia. 1. Niiden avulla voidaan etsiä syntetisoidun yhdistelmä-DNA:n klooneja geenipankista. 2 Myöhemmin tällaisia ​​vastaanottajasoluja voidaan käyttää kohdetuotteiden saamiseksi.

Rekombinantti-DNA:n lisäämismenetelmä otetaan huomioon sen perusteella, minkä tyyppisestä vektorista tällainen yhdistelmä-DNA on saatu ja minkä organismien soluihin se on tarpeen viedä transformoimalla solu tai protoplasti tai käyttämällä elektroporaatiomenetelmää. Jos rekombinantti-DNA saadaan faagien perusteella, se voidaan viedä eristettyyn DNA:han - tämä on transvektio. On mahdollista tuoda koskemattomia faagihiukkasia - tämä on infektio (kosmidit, phasmidit).

DR. geneettisen vaihdon menetelmät - konjugaatio, transduktio.

Kasvisoluissa - kasvien protoplastien transformaatio, kasvisolujen tai -kudosten käsittely yhdistelmä-DNA:lla; yhdistelmä-DNA:n injektioita tumaan käytetään laajalti; liposomien käyttöä. Liposomit ovat pallomaisia ​​rakenteita, joissa on lipidikuori, jonka sisällä on yhdistelmä-DNA:ta. Eläinsoluihin viemiseen - virusinfektiot, elektroporaatiomenetelmä, mikroinjektiot ytimeen. Jos yhdistelmä-DNA:n lisäämisen jälkeen kaikki kehon solut perivät sen, puhutaan siirtogeenisen organismin hankkimisesta.

Elektroporaatio - solut tai protoplastit altistetaan korkeajännitevirralle (2000-4000 volttia) lyhyen aikaa. Tämän seurauksena solukalvoon muodostuu huokosia n. 30 nm, joka voi olla olemassa 1-2 minuuttia ja jonka kautta yhdistelmä-DNA voi päästä soluun. Sitten huokoset sulkeutuvat ja DNA jää soluun. Tämä on universaali tapa.

ballistinen menetelmä- käytetään pääasiassa eukaryooteissa. Käytetään ballistisia tykkejä, joihin syötetään AK- tai W-hiukkasia, joille ruiskutetaan yhdistelmä-DNA:ta. Sitten P:ssä olevien inerttien kaasujen avulla tällaiset hiukkaset ammutaan aseesta soluviljelmään. Erilaisten kuvioiden mukaan osa hiukkasista pääsee tumaan ja yhdistelmä-DNA säilyy siellä.

Etsi klooneja yhdistelmä-DNA:lla.

Tämä vaihe on vaikea ja arvaamaton.

Yksinkertaisin menetelmä on etsiä klooneja fenotyypin mukaan yhdistelmä-DNA:n lisäämisen jälkeen(esim. pigmentaatio). Komplementtitestejä voidaan käyttää, mutta tarvitaan mutanttisoluja, jotka ovat puutteellisia aktiivisen tuotteen synteesissä.

Hybridisaatiomenetelmät - spesifisten leimattujen DNA- tai RNA-koettimien läsnäolo vaaditaan. Useammin ne on merkitty P 32:lla. Anturit m. lyhyet oligonukleotidisekvenssit, jotka vastaavat etsityn geenin konservatiivisinta osaa. Nämä konservoituneet sekvenssit voivat sisältää jopa 100 nukleotidia prokaryooteille ja jopa 1000 eukaryooteille.

Yhdistelmä-DNA:n lisäämisen jälkeen alustalle muodostuneet pesäkkeet siirretään erityiseen nitroselluloosasuodattimeen. Ne lyysataan ja sitä seuraava DNA denaturoidaan alkalia käyttämällä. DNA sitoutuu voimakkaasti suodattimeen. Suodatin pestään ja käsitellään radioaktiivisesti leimatulla koettimella ja määritetään klooni, jonka kanssa tämä koetin on ollut kosketuksessa.

Immunokemialliset menetelmät - kloonit yhdistelmä-DNA:n lisäämisen jälkeen hajotetaan ja käsitellään vastaavan tuotteen vasta-aineilla. Nämä vasta-aineet on leimattu.

Johdanto

1 Geenitekniikan entsyymien pääryhmät

1.1 Restriktioentsyymit

1.1.1 Rajoitusten vaikutusmekanismi

1.1.2 Rajoituskarttojen rakentaminen

1.3 Ligaasit

2 Uuden geenin vieminen soluun

2.1 Geeniekspression säätely prokaryooteissa

2.2 Menetelmät geenin viemiseksi suoraan soluun

2.3 Geenien vieminen nisäkässoluihin

2.4 Nisäkkäiden somaattisten solujen geneettinen transformaatio

2.5 Geeniterapia

2.6 Siirtogeenisten eläinten saaminen

Johtopäätös

Bibliografia

Johdanto

Geenitekniikka on toiminnallisesti aktiivisten geneettisten rakenteiden (yhdistelmä-DNA) rakentamista in vitro tai toisin sanoen keinotekoisten geneettisten ohjelmien luomista (Baev A. A.). E. S. Piruzyanin mukaan geenitekniikka on järjestelmä kokeellisia menetelmiä, jotka mahdollistavat keinotekoisten geneettisten rakenteiden rakentamisen laboratoriossa (koeputkessa) niin sanottujen rekombinantti- tai hybridi-DNA-molekyylien muodossa.

Puhumme suunnatusta, ennalta määrätyn ohjelman mukaisesti, molekyyligeneettisten järjestelmien rakentamisesta kehon ulkopuolelle ja niiden myöhemmäksi viemisestä elävään organismiin. Tässä tapauksessa yhdistelmä-DNA:sta tulee olennainen osa vastaanottavan organismin geneettistä laitteistoa ja se antaa sille uusia ainutlaatuisia geneettisiä, biokemiallisia ja sitten fysiologisia ominaisuuksia.

Sovellettavan geenitekniikan tavoitteena on suunnitella sellaisia ​​rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka geenilaitteistoon lisättynä antaisivat keholle ihmisille hyödyllisiä ominaisuuksia.

Yhdistelmä-DNA-tekniikka käyttää seuraavia menetelmiä:

DNA:n spesifinen pilkkominen restriktionukleaaseilla, mikä nopeuttaa yksittäisten geenien eristämistä ja manipulointia;

Puhdistetun DNA-fragmentin kaikkien nukleotidien nopea sekvensointi, jonka avulla voit määrittää geenin ja sen koodaaman aminohapposekvenssin rajat;

Yhdistelmä-DNA:n rakentaminen;

Nukleiinihappohybridisaatio, joka mahdollistaa spesifisten RNA- tai DNA-sekvenssien havaitsemisen suuremmalla tarkkuudella ja herkkyydellä perustuen niiden kykyyn sitoa komplementaarisia nukleiinihapposekvenssejä;

DNA-kloonaus: in vitro -monistaminen polymeraasiketjureaktiolla tai DNA-fragmentin lisääminen bakteerisoluun, joka sellaisen transformaation jälkeen tuottaa tämän fragmentin miljoonina kopioina;

Yhdistelmä-DNA:n vieminen soluihin tai organismeihin.

Geenitekniikan historia

Geenitekniikka ilmestyi monien biokemian ja molekyyligenetiikan eri alojen tutkijoiden työn ansiosta. Useiden vuosien ajan proteiineja on pidetty makromolekyylien pääluokana. Oli jopa oletus, että geenit ovat proteiiniluonteisia. Vasta vuonna 1944 Avery, McLeod ja McCarthy osoittivat, että DNA on perinnöllisen tiedon kantaja. Siitä lähtien alkoi intensiivinen nukleiinihappojen tutkimus. Kymmenen vuotta myöhemmin, vuonna 1953, J. Watson ja F. Crick loivat kaksijuosteisen DNA-mallin. Tätä vuotta pidetään molekyylibiologian syntymävuotena.

1950- ja 1960-lukujen vaihteessa geneettisen koodin ominaisuuksia selvitettiin ja 1960-luvun lopulla sen universaalisuus vahvistettiin kokeellisesti. Molekyyligenetiikkaa kehitettiin intensiivisesti, ja sen kohteena olivat E. coli, sen virukset ja plasmidit. Menetelmiä on kehitetty eristämään erittäin puhdistettuja ehjät DNA-molekyylejä, plasmideja ja viruksia sisältäviä valmisteita. Virusten ja plasmidien DNA vietiin soluihin biologisesti aktiivisessa muodossa, mikä varmisti sen replikoitumisen ja vastaavien geenien ilmentymisen. 70-luvulla löydettiin useita entsyymejä, jotka katalysoivat DNA-transformaatioreaktioita. Restriktioentsyymeillä ja DNA-ligaaseilla on erityinen rooli geenitekniikan menetelmien kehittämisessä.

Geenitekniikan kehityksen historia voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen. Ensimmäinen vaihe liittyy todisteeksi perustavanlaatuisesta mahdollisuudesta saada yhdistelmä-DNA-molekyylejä in vitro. Nämä työt koskevat hybridien tuotantoa eri plasmidien välillä. Mahdollisuus luoda rekombinanttimolekyylejä käyttämällä alkuperäisiä DNA-molekyylejä eri bakteerilajeista ja -kannoista, niiden elinkelpoisuus, stabiilisuus ja toiminta osoitettiin.

Toinen vaihe liittyy työn aloittamiseen rekombinantti-DNA-molekyylien saamiseksi prokaryoottien kromosomaalisten geenien ja erilaisten plasmidien välillä, mikä todistaa niiden stabiilisuuden ja elinkelpoisuuden.

Kolmas vaihe on työ eukaryoottisten geenien, pääasiassa eläingeenien, sisällyttämiseksi vektori-DNA-molekyyleihin (geeninsiirtoon käytettävä DNA, joka voidaan integroida vastaanottavan solun geneettiseen laitteistoon).

Muodollisesti geenitekniikan syntymäaikaa tulisi pitää vuotta 1972, jolloin P. Berg, S. Cohen, H. Boyer ja työtoverit loivat ensimmäisen yhdistelmä-DNA:n, joka sisälsi SV40-viruksen, bakteriofagin ja E. colin DNA-fragmentteja Stanfordissa. Yliopisto.

1 Geenitekniikan entsyymien pääryhmät

Geenitekniikka on molekyyligenetiikan jälkeläistä, mutta syntyessään geneettisen entsymologian ja nukleiinihappokemian menestyksen ansiota, koska entsyymit ovat molekyylimanipuloinnin välineitä. Jos voimme joskus työskennellä solujen ja soluelinten kanssa mikromanipulaattoreilla, niin pienimmätkään mikrokirurgiset instrumentit eivät auta DNA- ja RNA-makromolekyylien kanssa työskentelyssä. Mitä tehdä? Entsyymit toimivat "veitsenä", "saksina" ja "ompelulankoina".

Vain he voivat löytää tiettyjä nukleotidisekvenssejä, "leikata" sinne molekyylin tai päinvastoin "hituttaa" reiän DNA-ketjuun. Nämä entsyymit ovat työskennelleet solussa pitkään tehden työtä DNA:n replikaatioon (kaksinkertaistumiseen) solun jakautumisen aikana, vaurioiden korjaamiseen (molekyylin eheyden palauttamiseen), geneettisen tiedon luku- ja siirtoprosesseissa solusta soluun tai solun sisällä. Geeniinsinöörin tehtävänä on valita entsyymi, joka täyttäisi asetetut tehtävät, eli se voisi toimia tietyn nukleiinihapon osan kanssa.

On huomattava, että geenitekniikassa käytetyt entsyymit eivät ole lajispesifisiä, joten kokeen tekijä voi yhdistää minkä tahansa alkuperän DNA-fragmentteja yhdeksi kokonaisuudeksi valitsemassaan sekvenssissä. Tämä mahdollistaa geenitekniikan avulla luonnon luomien lajiesteiden ylittämisen ja lajien välisen risteytyksen.

Yhdistelmä-DNA:n rakentamisessa käytetyt entsyymit voidaan jakaa useisiin ryhmiin:

Entsyymit, jotka tuottavat DNA-fragmentteja (restriktioentsyymit);

Entsyymit, jotka syntetisoivat DNA:ta DNA (polymeraasi) tai RNA (käänteiskopioija) -templaatissa;

Entsyymit, jotka yhdistävät DNA-fragmentteja (ligaasit);

Entsyymit, jotka mahdollistavat DNA-fragmenttien päiden rakenteen muuttamisen.

1.1 Restriktioentsyymit

On yleisesti hyväksyttyä, että termejä "restriktioentsyymi", "restriktioendonukleaasi" ja "kohtaspesifinen endodeoksiribonukleaasi" pidetään synonyymeinä.

Kaikki bakteerien restriktioendonukleaasit tunnistavat spesifisiä, melko lyhyitä DNA-sekvenssejä ja sitoutuvat niihin. Tähän prosessiin liittyy DNA-molekyylin leikkaaminen joko itse tunnistuskohdassa tai jossain muussa kohdassa, joka määräytyy entsyymin tyypin mukaan. Restriktioaktiivisuuden ohella bakteerikannalla on kyky metyloida DNA:ta; tälle menetelmälle on tunnusomaista sama spesifisyys DNA-sekvensseille kuin restriktiolle. Metylaasi lisää metyyliryhmiä adeniini- tai sytosiinitähteisiin samassa kohdassa, johon restriktioentsyymi sitoutuu. Metylaation seurauksena kohdasta tulee vastustuskykyinen restriktiolle. Siksi metylaatio suojaa DNA:ta katkomiselta.

Rajoitusten pääluokkaa on kolme: 1, 2 ja 3.

Kaikki restriktioentsyymit tunnistavat tiukasti määritellyt sekvenssit kaksijuosteisesta DNA:sta, mutta 1. luokan restriktioentsyymit tekevät katkoja mielivaltaisissa DNA-molekyylin kohdissa, ja 2. ja 3. luokan restriktioentsyymit tunnistavat ja katkaisevat DNA:n tiukasti määritellyistä kohdista DNA-molekyylissä. tunnistuspaikoista tai kiinteällä etäisyydellä niistä.

Tyyppien 1 ja 3 entsyymeillä on monimutkainen alayksikkörakenne, ja niillä on kahdentyyppisiä aktiivisuuksia - modifioiva (metyloiva) ja ATP-riippuvainen endonukleaasi.

Toisen luokan entsyymit koostuvat kahdesta erillisestä proteiinista: restriktioendonukleaasista ja modifioivasta metylaasista, joten geenitekniikassa käytetään vain luokan 2 entsyymejä. He tarvitsevat magnesiumioneja kofaktoreina.

Tällä hetkellä on eristetty yli 500 luokan 2 restriktaasia, mutta erilaisista mikro-organismeista eristettyjen entsyymien joukossa on niitä, jotka tunnistavat samat sekvenssit DNA:sta. Tällaisia ​​pareja tai ryhmiä kutsutaan isoskizomereiksi. Todellinen isoskitsomerismi erotetaan, kun entsyymit tunnistavat saman nukleotidisekvenssin ja rikkovat DNA:n samoista kohdista, ja väärä, kun entsyymit tunnistavat saman kohdan DNA:ssa, tekevät katkoksia saman kohdan eri kohdissa.

Useimmat luokan 2 restrikaasit tunnistavat sekvenssejä, jotka sisältävät 4 - 6 nukleotidiparia, joten restrikaasit jaetaan pieniin ja suuriin. Pienileikkaavat restriktioentsyymit tunnistavat tetranukleotidin ja tuovat paljon enemmän katkoja molekyyleihin kuin suuret restriktioentsyymit, jotka tunnistavat kuuden nukleotidiparin sekvenssin. Tämä johtuu siitä, että tietyn neljän nukleotidin sekvenssin esiintymistodennäköisyys on paljon suurempi kuin kuuden nukleotidin sekvenssi. Esimerkiksi T7-bakteriofagin 40 000 emäsparin DNA:sta puuttuu sekvenssi, jonka R1 tunnistaa E. colista.

Pienen halkaisevia restriktaasseja ovat Hpa II ja Alu (Arthrobacter luteuksesta), suuren halkaisun aiheuttavat - Eco R I (Escherichia colista) ja Hind III. Jos oletetaan, että restriktioentsyymin tunnistuskohdat ovat jakautuneet satunnaisesti pitkin DNA-ketjua, neljän nukleotidin sekvenssin (kohdan) tunnistavien entsyymien kohteen tulisi esiintyä keskimäärin kerran 256 emäsparia kohti ja kuusi nukleotidia tunnistavien entsyymien kohteen 4096 emäsparia. Jos restriktiokohta on geenin sisällä, niin käsittely DNA-restriktioentsyymillä johtaa sen inaktivoitumiseen. Tällaisen tapahtuman todennäköisyys on erittäin suuri, kun sitä käsitellään pienileikkauksilla restriktaaseilla, ja merkityksetön käytettäessä suurileikkaus endonukleaaseja. Siksi ehjän geenin saamiseksi pilkkominen suoritetaan vuorotellen useilla suurileikkauksilla restriktaaseilla tai käytetään "alirajoitus"-menetelmää, ts. restriktio suoritetaan olosuhteissa, joissa katkaisu tapahtuu vain yhdessä kohdassa.