ELISA for syfilis er positiv: hvad betyder det, når analysen dechifreres. Hvordan udføres det, og hvad viser enzymimmunoassay Hvad er b a f

Samoilikov Pavel Vladimirovich Praktikant fra afdelingen for klinisk laboratoriediagnostik

Russian State Medical University

Immunoassay-metoder er blevet meget anvendt i medicinsk praksis. I alle områder af moderne medicin anvendes immunoassay, hovedsageligt til diagnostiske og analytiske formål. Det er især vigtigt, at de gør det muligt at identificere biologiske komponenter (hormoner, enzymer, neuropeptider, immunsystemprodukter, antigener osv.) i lave og meget lave koncentrationer. Alle produkter, mod hvilke det er muligt at opnå antistoffer, påvises ved disse metoder.

Immunanalyse er baseret på interaktionen mellem et antigen (AG) og et antistof (AT) ved hjælp af forskellige mærkningsmuligheder for en af ​​komponenterne (enzym, radionuklid, fluorescerende farvestof og andre). Evaluering af reaktionen udføres automatisk på specialudstyr, som gør det muligt at standardisere disse metoder.

Afhængigt af den anvendte type mærke og betingelserne for opsætning af testen, omtales immunoassayet som enzymimmunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescerende og andre. Når reaktioner iscenesættes i et eller flere trin, betegnes de som direkte eller indirekte. Mediet, hvori reaktionen udføres, har betydning. Hvis reaktionen udføres med reagenser fikseret på overfladen, betegnes testen som en fastfasetest, for eksempel ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

I denne artikel vil kun enzymimmunoassay blive overvejet - en metode, der er meget udbredt i biologi og medicin, både praktisk og fundamental.

ELISA dukkede op i midten af ​​60'erne og blev oprindeligt udviklet som en metode til at identificere et antigen i et histologisk præparat, samt til at visualisere udfældningslinjer i en immundiffusionstest og immunelektroforese, og begyndte derefter at blive brugt til kvantitativ bestemmelse af antigener og antistoffer i biologiske væsker. E. Engvall og R. Pelman deltog i udviklingen af ​​metoden, samt, uafhængigt af dem, W. Van Veeman og R. Schurs.

Figur 1. Grundlæggende princip for ELISA.

1) At påvise antigener. 2) At påvise antistoffer.

Metoden er baseret på den specifikke binding af et antistof til et antigen, mens en af ​​komponenterne er konjugeret med et enzym; som et resultat af reaktionen med det tilsvarende kromogene substrat dannes et farvet produkt, hvis mængde kan være bestemt spektrofotometrisk (fig. 1).

Opdagelsen af ​​muligheden for immobilisering af antigen og antistof på forskellige bærere, mens deres bindingsaktivitet bibeholdes, har gjort det muligt at udvide anvendelsen af ​​ELISA inden for forskellige områder af biologi og medicin.

Udseendet af monoklonale antistoffer tjente som en videreudvikling af ELISA, som gjorde det muligt at øge dets følsomhed, specificitet og reproducerbarhed af resultater.

Teoretisk er ELISA baseret på data fra moderne immunkemi og kemisk enzymologi, viden om de fysisk-kemiske love for antigen-antistof-reaktionen samt på hovedprincipperne for analytisk kemi. Følsomheden af ​​ELISA og dets varighed bestemmes af flere hovedfaktorer: de kinetiske og termodynamiske egenskaber af antigen-antistof-reaktionen, forholdet mellem reagenser, enzymaktivitet og opløsningen af ​​dets påvisningsmetoder. Generelt kan antigen-antistof-reaktionen beskrives ved et simpelt skema:

+[AG]↔[ATAG]

De mange forskellige undersøgelsesobjekter fra forbindelser med lav molekylvægt til vira og bakterier samt en usædvanlig bred vifte af opgaver forbundet med en række betingelser for brugen af ​​ELISA bestemmer udviklingen af ​​et ekstremt stort antal varianter af denne metode .

Enhver ELISA-variant indeholder 3 obligatoriske stadier:

1. stadiet for genkendelse af testforbindelsen af ​​et antistof specifikt for den, hvilket fører til dannelsen af ​​et immunkompleks;

2. dannelsesstadiet for forbindelsen af ​​konjugatet med immunkomplekset eller frie bindingssteder;

3. stadiet med omdannelse af enzymmærket til et registreret signal.

Klassificeringen af ​​ELISA-metoder er baseret på flere tilgange:

1. I henhold til typen af ​​reagenser, der er til stede i det første trin af ELISA, skelnes der mellem konkurrerende og ikke-konkurrerende metoder.

A) Ved kompetitiv ELISA indeholder systemet i første fase både den analyserede forbindelse og dens analog, mærket med enzymet og konkurrerer om specifikke bindingssteder med det.

B) For ikke-konkurrerende metoder er tilstedeværelsen i systemet i første fase af kun den analyserede forbindelse og bindingscentre, der er specifikke for den, karakteristisk.

2. Alle ELISA-metoder er opdelt i homogene og heterogene.

Hvis alle tre trin af ELISA udføres i opløsning, og der mellem hovedstadierne ikke er yderligere trin til adskillelse af de dannede immunkomplekser fra uomsatte komponenter, tilhører metoden gruppen af ​​homogene.

Grundlaget for homogen ELISA, som sædvanligvis bruges til at bestemme lavmolekylære stoffer, er hæmningen af ​​enzymaktivitet, når det kombineres med et antigen eller antistof. Enzymaktiviteten genoprettes som et resultat af antigen-antistof-reaktionen.

Når et antistof binder til et antigen indeholdende et enzymmærke, hæmmes enzymaktiviteten med 95 % i forhold til et substrat med høj molekylvægt, hvilket skyldes den steriske udelukkelse af substratet fra enzymets aktive center. Når koncentrationen af ​​antigen stiger, binder flere antistoffer, og flere frie antigen-enzymkonjugater tilbageholdes, som kan hydrolysere substratet med høj molekylvægt. Analysen udføres meget hurtigt, 1 minut er påkrævet for en bestemmelse. Metodens følsomhed er ret høj. Med det kan du bestemme stoffet på niveau med picomoler.

For heterogene metoder er det typisk at udføre analyse i et tofasesystem med deltagelse af en fast fase - en bærer og et obligatorisk trin for adskillelse af immunkomplekser fra uomsatte komponenter (vask), der er i forskellige faser (dannet immunkomplekser er på den faste fase, og uomsatte komplekser er i opløsning). Heterogene metoder, hvor dannelsen af ​​immunkomplekser i det første trin fortsætter på den faste fase, kaldes fast-fase metoder.

Metoder klassificeres som homogene-heterogene, hvis 1. trin - dannelsen af ​​specifikke komplekser sker i opløsning, og derefter bruges en fast fase med et immobiliseret reagens til at adskille komponenterne.

3. Ifølge princippet om bestemmelse af teststoffet:

A) Direkte bestemmelse af koncentrationen af ​​et stof (antigen eller antistof) ved antallet af bindingscentre, der interagerer med det. I dette tilfælde vil enzymmærket være i det resulterende specifikke AG-AT-kompleks. Koncentrationen af ​​analytten vil være direkte proportional med det registrerede signal.

B) Bestemmelse af koncentrationen af ​​et stof ved forskellen mellem det samlede antal bindingssteder og de resterende frie bindingssteder. I dette tilfælde vil koncentrationen af ​​analytten stige, og det registrerede signal vil falde, derfor er der i dette tilfælde en omvendt afhængighed af størrelsen af ​​det registrerede signal.

Enzymer.

Enzymmærker har en ekstremt kraftig katalytisk effekt; ét enzymmolekyle kan reagere med et stort antal substratmolekyler. Således kan et enzym, der er til stede i ubetydelige mængder, påvises og kvantificeres ved dannelsen af ​​produkter, den reaktion det katalyserer. En anden fordel ved at bruge enzymer som mærker skyldes tilstedeværelsen i molekylet af adskillige funktionelle grupper (sulfhydryl, carboxyl, tyrazinrester osv.), gennem hvilke ligandmolekyler kan bindes kovalent.

Enzymatiske markører brugt i ELISA bør have følgende egenskaber:

- høj aktivitet og stabilitet af enzymet under analysebetingelserne, under modifikation og i konjugat med antistoffer eller andre proteiner;

– tilstedeværelsen af ​​følsomme substrater og enkelheden af ​​metoden til bestemmelse af produkterne eller substraterne for den enzymatiske reaktion;

– mulighed for tilpasning af substratsystemer til yderligere forstærkning;

- fraværet af enzymet og dets inhibitorer i den undersøgte biologiske væske.

ELISA kan bruge mindst 15 forskellige enzymer. Den største anvendelse, i overensstemmelse med ovenstående krav, fandt peberrodsperoxidase (HRP), alkalisk phosphatase (AP) og β-D-galactosidase (tabel 1). Alle tre er stabile og katalyserer meget følsomme reaktioner. Desuden kan produkterne, der er et resultat af reaktionerne katalyseret af disse enzymer, afhængigt af det anvendte substrat, detekteres ikke kun ved kolorimetriske metoder, men også ved fluorescerende metoder. Andre enzymer bruges meget sjældnere. Dette forklares med deres lavere specifikke aktivitet sammenlignet med HRP og AP.

Underlag.

Valget af substrat bestemmes primært af det enzym, der anvendes som mærke, da enzym-substrat-reaktionen er meget specifik.

Grundlæggende krav til underlaget:

– sikring af høj følsomhed af metoden til påvisning af enzymet i konjugatet;

– dannelse af veldefinerede (for eksempel farvede) produkter af enzym-substrat-reaktionen;

– underlaget skal være sikkert, billigt, tilgængeligt og bekvemt at bruge.

Tabel 1.

Enzymer og deres substrater er de mest udbredte i ELISA.

Oftere anvendes kromogene substrater, som, når de ødelægges, danner et farvet stof. Lovende er brugen af ​​højenergisubstrater - fluorescerende, kemiluminescerende. Anvendelsen af ​​sådanne substrater gør det teoretisk muligt at øge følsomheden af ​​ELISA med to størrelsesordener.

Antigener og antistoffer.

AG og AT anvendt i ELISA bør være højt oprensede og yderst aktive. Derudover bør AG have høj antigenicitet, optimal tæthed og antal antigene determinanter, fremmedhed og homogenitet. Mange syntetiske og rekombinante antigener af vira og bakterier har vist sig godt, når de anvendes i ELISA. Dette øgede markant metodens specificitet og reproducerbarhed ved at minimere krydsreaktioner.

Et af de vigtigste reagenser i ELISA er antistoffer. ELISA-sensitivitet afhænger af koncentrationen, aktiviteten og specificiteten af ​​de anvendte antistoffer. De anvendte antistoffer kan være poly- eller monoklinale, af forskellig klasse (IgG eller IgM) og underklasse (IgGl, IgG2), anti-allotypiske eller anti-idiotypiske. Ved lav AT-affinitet fører nedbrydningen af ​​AG-AT-komplekset til fjernelse af bundet AG fra systemet. Følsomheden og specificiteten af ​​metoden øges ved anvendelse af monoklonale antistoffer. I dette tilfælde bliver det muligt at påvise lave koncentrationer af AG (AT) i testprøverne.

Konjugeret dannelse

Et konjugat er et antigen eller antistof mærket med et enzymmærke. Dannelsen af ​​et konjugat er et af de vigtige trin i ELISA.

Ved dannelse af konjugatet vælges en sådan optimal metode til at introducere et enzymmærke, således at begge komponenter i konjugatet bevarer deres biologiske aktivitet: enzymet - evnen til at interagere med substratet, og antigenet eller antistoffet - antigenicitet og antigenbinding aktivitet, hhv. Tilstedeværelsen af ​​mærket, højt oprenset antigen tillader anvendelsen af ​​konkurrerende metoder. I dette tilfælde kan aktiviteten af ​​konjugatet, der ikke er bundet til immobiliserede antistoffer, måles i det sidste trin, hvilket undgår vaskeproceduren og gør analysen mere bekvem. Antigener er dog forskellige i deres fysisk-kemiske egenskaber og struktur, hvilket betyder, at det er umuligt at udvikle universelle metoder til at opnå et konjugat med et antigen. I dette tilfælde er opnåelse af et antigen-enzymkonjugat en separat udfordring. Fremstillingen af ​​mærkede antistoffer til ELISA er metodisk mere tilgængelig.

Konjugering af et enzym med immunokemisk aktive proteiner udføres ved forskellige metoder: kemisk tværbinding, kovalent binding af et enzymmolekyle til en AG eller AT, og dannelse af forbindelser gennem ikke-kovalente bindinger, for eksempel når forbindelsen mellem enzym og AG eller AT udføres immunologisk gennem antigen-antistof-interaktion.

De mest udbredte kovalente metoder til fremstilling af konjugater. Valget af bindingsreaktion bestemmes af typen af ​​funktionelle grupper, der er tilgængelige i disse proteinmolekyler. Glutaraldehyd, natriumperjodat osv. bruges som reagenser, der bruges til at introducere enzymet i antigen- og antistofmolekyler.

Der er et-trins og to-trins metoder til at opnå konjugater ved hjælp af glutaraldehyd. Konjugater af forskellige størrelser med reduceret enzymatisk aktivitet (15 - 60% af det frie enzym) kan dannes. Det resulterende konjugat i stor størrelse kan sterisk hindre bestemmelsen af ​​teststoffet. Relativt lavmolekylære konjugater består af et Fab-fragment og et enzymmolekyle.

Som et resultat af en to-trins syntese, som består i den trinvise fremstilling af et enzym først modificeret med et tværbindingsmiddel, dets isolering og derefter dets efterfølgende interaktion med et antigen (antistof), molekyler af en Der dannes homogene sammensætninger indeholdende 1-2 enzymmolekyler pr. immunglobulinmolekyle og opretholder en høj enzymatisk og immunologisk aktivitet. Mængden af ​​sådanne dannede konjugater er imidlertid lille (for peberrodsperoxidase er den 5-10%).

Fremgangsmåden til opnåelse af immunoperoxidasekonjugater, baseret på oxidationen af ​​enzymets kulhydratkomponent med natriumperiodat (bindingen af ​​peroxidase til konjugatet når 70-90% af den oprindelige mængde af enzymet), har fundet den største praktiske anvendelse.

Et pålideligt konjugat skal have følgende egenskaber:

Høj antistoftiger og høj affinitet for antigenet, så det kan bruges i høj fortynding og dermed reducere uspecifik binding;

Tilstrækkelig specificitet i arbejdende avl;

Overvægten af ​​monomere former over polymere, fordi polymere former har tendens til at klæbe uspecifikt til plast, hvilket resulterer i et højt baggrundsniveau af reaktion;

Det optimale molære forhold mellem enzymet og antistofferne (det optimale forhold er ca. 1:1);

Tilstrækkelig enzymatisk aktivitet af konjugatet. Denne egenskab bestemmes hovedsageligt af betingelserne for konjugation og forholdet mellem enzym- og antistofmolekyler i konjugatet.

fast fase

Forskellige materialer kan bruges som fast fase til ELISA: polystyren, polyvinylchlorid, polypropylen og andre stoffer. Den faste fase kan være væggene i et reagensglas, 96-brønds og andre plader, kugler, perler, samt nitrocellulose og andre membraner, der aktivt absorberer proteiner.

Immobilisering af antigen eller antistoffer på den faste fase er mulig på tre måder:

– passiv adsorption baseret på stærke hydrofobiske interaktioner mellem proteiner og en syntetisk overflade;

- kovalent binding til den faste fase;

– immunkemisk osv. (ikke-kovalent og ikke-adsorptionsvedhæftning).

Passiv adsorption af proteiner er meget udbredt, når der udføres ELISA på titreringsplader, på nitrocellulosemembraner. Passiv adsorption følger princippet om mætning og korrelerer med molekylvægten af ​​det adsorberede stof. Adsorptionsoverfladen på membraner af forskellige typer (nitrocellulose, nylon osv.) er 100-1000 gange højere end plastik.

Polysaccharider og højt glycosylerede proteiner har ofte lav affinitet til polystyren. Andre metoder er nødvendige for at immobilisere dem, såsom kovalent binding med glutaraldehyd. Kovalent binding er effektiv, hvis hydrofile perler (agarose) og polystyrenperler anvendes som den faste fase.

Immunokemiske metoder er baseret på brugen af ​​præ-adsorberede "fælde"-antistoffer til at immobilisere antigenet eller antistofferne. Det immunkemisk immobiliserede antigen er 10 gange mere aktivt end det passivt adsorberede antigen. Kan anvendes lectiner eller immunglobulinbindende proteiner fra bakterier, der let adsorberes på plastik eller andre hydrofobe overflader, såsom concanavalin A (Con A) eller stafylokokkprotein A. Con A er i stand til at immobilisere gp 120-proteinet fra HIV-viruset.

Frie steder på overfladen af ​​den faste fase, som ikke er bundet til det sorberede middel, kan fiksere andre molekyler under testen, herunder konjugater, hvilket fører til en stigning i baggrundssignalet. For at forhindre uspecifik binding efter immobilisering på grundmaterialets faste fase, udføres behandlingen med stoffer, der er neutrale for testen. De mest populære blokeringsmidler er bovint serumalbumin (BSA), kasein osv. Valget af blokeringsmiddel og betingelserne for dette stadie afhænger af typen af ​​fast fase, systemets følsomhed.

I øjeblikket bruges et stort antal forskellige varianter og modifikationer af ELISA. Forskellige varianter af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) er blevet udbredt.

Fastfase ELISA blev foreslået i 1971. De grundlæggende principper for fastfase ELISA, uanset modifikation, er som følger:

1. På 1. trin af reaktionen adsorberes antigener eller antistoffer på den faste fase. I dette tilfælde fjernes de reagenser, der ikke er bundet til den faste fase, let ved vask.

2. Testprøven inkuberes i de sensibiliserede brønde. Positive kontrolbrønde indeholder standardreagenser. I dette tilfælde dannes immunkomplekser på overfladen af ​​den faste fase. Ubundne komponenter fjernes ved vask.

3. Når man tilføjer et antistof-enzym eller antigen-enzym-konjugat og binder det til det immobiliserede immunkompleks, forbliver det aktive sted af enzymet tilgængeligt til efterfølgende interaktion med substratet. Inkubation af substratet i brønde med immobiliseret konjugat fører til udvikling af en farvereaktion. Denne reaktion kan standses på det ønskede stadie, farvningens sværhedsgrad kan vurderes visuelt eller ved optisk tæthed.

Et vigtigt trin i enhver variant af fastfaseanalyse er proceduren til afvaskning af ubundne reagenser. Det er vigtigt ikke kun at skylle komponenterne fastgjort på den faste fase, men at fjerne reagenserne fra hele lagets dybde. Disse er de mest tidskrævende og arbejdskrævende faser af analysen. Prøver kan vaskes automatisk ved hjælp af en speciel enhed - en vaskemaskine eller manuelt med en flerkanalspipette. For at udføre en ELISA skal du:

– anvendt polystyren-tablet eller andre fastfase-optioner;

- vaskeopløsning;

– konjugat (enzymatisk mærkede antigener eller antistoffer);

– blanding af brugte substrater;

- stopopløsning (Stop reagens - opløsning for at stoppe reaktionen);

- prøver anvendt til positiv og/eller negativ kontrol;

– standardantigen (til opbygning af en kalibreringskurve);

– enkelt- og flerkanalspipetter;

– vaskemaskine (vasker);

– en optisk anordning til bestemmelse af testopløsningens optiske densitet (ELISA-læser, en læser, der sekventielt fotometrer alle brønde);

- 5-100 µl af det undersøgte biologiske materiale.

Direkte ELISA

1. Antigener eller antistoffer (testmateriale) adsorberes i panelernes brønde. Det blev bemærket ovenfor, at antigener signifikant adskiller sig i deres evne til at blive adsorberet på forskellige typer plastik, afhængigt af hvilken klasse af stoffer (proteiner, kulhydrater eller lipoproteiner) de tilhører. Ofte i direkte ELISA er antigenet immobiliseret på den faste fase celler og andre partikelformige antigener.

Styring. Som kontrol anvendes brønde med en adsorberet positiv kontrolprøve, som nødvendigvis indeholder det ønskede antigen, og en negativ kontrolprøve, som naturligvis ikke indeholder testantigenet. I nærvær af et oprenset standardantigen udføres reaktionen i flere fortyndinger, således at en kalibreringskurve kan konstrueres.

2. "Bloker frie bindingssteder tilbage på den faste fase med kasein BSA osv. (for at forhindre uspecifik sorption af konjugatet på den faste fase).

3. Enzymmærkede antistoffer eller antigener (konjugat) tilsættes til brøndene og inkuberes. Bindingen af ​​konjugatet til den faste fase vil kun forekomme, hvis begge komponenter i systemet er komplementære. Efter inkubation med konjugatet vaskes brøndene, hvorved den ubundne del af konjugatet fjernes.

4. Det substrat, der er specifikt for det anvendte enzym, tilsættes derefter til brøndene og inkuberes. Når det optimale niveau af farvning i de positive kontrolbrønde er nået, standses enzymreaktionen.

5. Regnskab for reaktionen. Først tages der visuelt hensyn til resultaterne af reaktionen. For en mere nøjagtig redegørelse for resultaterne evalueres farvningsintensiteten på en ELISA-læser med et passende lysfilter. Ifølge resultaterne af analysen plottes en graf over den optiske densitets afhængighed af koncentrationen (fig. 2).

Figur 2. Direkte ELISA.

a) at påvise et antigen; b) at påvise antistoffer.

Denne variant af ELISA bruges normalt til at påvise specifikke antistoffer. Standardantigenet adsorberes i brøndene på panelerne og inkuberes med prøver af serum eller andet biologisk materiale opnået fra patienten (cerebrospinalvæske, spyt osv.). Specifikke antistoffer bundet til antigenet på den faste fase påvises ved anvendelse af et antiglobulinkonjugat. Afhængigt af formålet med analysen anvendes forskellige antiglobulinreagenser, der påviser antistoffer af alle isotyper eller specifikke for individuelle klasser og underklasser af immunglobuliner. Den største fordel ved metoden er konjugatets universalitet. Det samme konjugat kan anvendes til at påvise humane antistoffer mod en lang række antigener i enhver prøve. Reaktionen er metodisk simpel.

De vigtigste stadier af indirekte ELISA til påvisning af antistoffer:

1. Antigenet adsorberes på den faste fase og vaskes derefter af fra ubundne komponenter.

2. Bloker gratis bindingssteder. Vasket.

3. Testmaterialet tilsættes til brøndene, inkuberes og vaskes derefter. Sideløbende placeres prøver med positive og negative kontroller.

4. Tilsæt antiglobulinkonjugat i arbejdsfortynding, inkuber, vask ubundne komponenter af.

5. Substrat indføres, inkuberes. Når det optimale niveau af farvning er nået i de positive kontrolbrønde, standses reaktionen ved at tilsætte stopopløsning.

6. Mål mængden af ​​reaktionsproduktet på ELISA-læseren (fig. 3).

Under optimale assaybetingelser er metoden yderst specifik og følsom. Det giver dig mulighed for at detektere nanogram mængder af antistoffer i sera fra de undersøgte patienter. For at opnå tilfredsstillende resultater er standardisering af reagenser og metoder nødvendig. Denne ELISA-variant kan også bruges til at teste monoklonale antistoffer.

Antigener påvist under anvendelse af denne ELISA-variant skal have flere antistofbindende epitoper eller have gentagne, rumligt adskilte epitoper af samme specificitet.

Når denne variant af ELISA udføres, inkuberes meget specifikke poly- eller monoklonale antistoffer adsorberet på den faste fase med testprøven. Efter vaskeproceduren tilsættes enzymmærkede antistoffer (konjugat) til det samme antigen til brøndene, og derefter udføres alle andre trin af reaktionen. Effektiviteten af ​​dannelsen af ​​et specifikt kompleks på hvert trin af analysen afhænger af bindingskonstanten for antigen-antistof-reaktionen.

De vigtigste faser af analysen:

1. Monoklonale antistoffer eller affinitetsoprensede polyklonale antistoffer immobiliseres på den faste fase.

2. Testprøven indføres i panelernes brønde, en positiv kontrolprøve og en negativ kontrolprøve placeres parallelt i forskellige fortyndinger. Inkuberet og vasket.

3. Enzymmærkede monoklonale eller polyklonale antistoffer (konjugat) indføres i brøndene. Vask udføres efter inkubation.

4. Substrat indføres, inkuberes. Reaktionen standses, når optimal farvning er opnået i de positive kontrolbrønde.

5. Regnskab for resultater på ELISA-læseren.

Den største fordel ved metoden er dens høje følsomhed, som overstiger mulighederne for andre ELISA-skemaer (fig. 4).

Figur 3. Indirekte ELISA til påvisning af antistoffer.

Denne analysemulighed er baseret på konkurrencen mellem mærkede (konjugat) og umærkede (test) antistoffer om binding til antigenet adsorberet på den faste fase. Mængden af ​​enzym knyttet til den faste fase vil falde i forhold til indholdet af frie antistoffer i blandingen. For at bestemme antigenet bruges den samme mulighed, men i dette tilfælde konkurrerer det ønskede antigen med det mærkede standardantigen om binding til antistoffer immobiliseret på overfladen af ​​den faste fase.

Den konkurrencedygtige metode kræver et minimum af operationer, lavt forbrug af reagenser og kan nemt automatiseres. Når der udføres en kompetitiv ELISA til påvisning af antistoffer, er det bedre at bruge mærkede monoklinale antistoffer, så opstår konkurrencen af ​​konjugatet med testprøven for en enkelt epitop af antigenet adsorberet på den faste fase. Denne ELISA-variant bruges til at bestemme forskellige forbindelser, såsom humane immunoglobuliner, cancer-embryonalt antigen, insulin osv. Den tillader påvisning af antistoffer mod diagnostisk signifikante epitoper af infektiøse agenser.

De vigtigste stadier af analysen til påvisning af antigen (fig. 5):

1. Monoklonale antistoffer, der er specifikke for det antigen, der skal påvises, immobiliseres på den faste fase.

2. Tilføj antigenet mærket med enzymet og testprøven i en kendt koncentration til brøndene på panelerne. Udfør inkubation og vask. Sideløbende placeres positive og negative kontroller i tilstødende brønde. At bygge kalibreringen ved hjælp af et standard umærket antigen i forskellige fortyndinger.

3. Tilføj substrat, inkuber, stop reaktionen, når der udvikles optimal farvning i de positive kontrolbrønde.

4. Redegørelse for reaktionen på ELISA-læseren.

I dette tilfælde er mængden af ​​antigen i testprøven omvendt proportional med den enzymatiske aktivitet på den faste fase.

I denne variant af ELISA binder antigenet til stede i testprøven til enzymmærkede monoklonale antistoffer og hæmmer deres interaktion med standardantigenet immobiliseret på den faste fase. Tilstedeværelsen i prøven af ​​lige spormængder af antigen specifikt for konjugatet vil hæmme bindingen af ​​mærkede antistoffer til det immobiliserede antigen. Graden af ​​inhibering er direkte proportional med indholdet af antigenet i opløsningen. Til kvantitativ analyse opbygges en kalibreringskurve ved hjælp af serielle fortyndinger af standardantigenet. De vigtigste stadier af inhiberende ELISA til påvisning af antigen (fig. 6).

1. Adsorbér standardantigenet i brøndene på panelerne. Vælg en arbejdsfortynding af mærkede antistoffer ved titrering.

Figur 4. "Sandwich" - ELISA-variant.

2. Konjugatet præ-inkuberes ved arbejdsfortyndingen med fortyndinger af testprøven, standardantigen og positive kontrolprøver.

3. Blandingen overføres til panelernes brønde. For at kontrollere 100 % binding tilsættes kun mærkede antistoffer til flere brønde uden hæmmende antigen. Panelerne inkuberes og vaskes derefter.

4. Tilføj substrat.

5. Registrer resultaterne.

Koncentrationen af ​​antigenet, der skal bestemmes i testprøven, er omvendt proportional med den enzymatiske aktivitet på den faste fase.

ELISA kan ikke kun bruges til at bestemme et opløseligt antigen eller antistof, men også celler, der producerer forskellige proteiner.

I 1983 blev ELISA-teknologien tilpasset til påvisning af lymfoide celler, der udskiller antistoffer eller antigener (f.eks. cytokiner) in vitro. Metoden kaldes ELISPOT (enzymatisk immunoassay eller pletmetode). Metodens hovedprincip:

1. På overfladen af ​​en polystyrenbrønd (ved hjælp af cellekulturpaneler med 24 brønde) adsorberes antigener eller antistoffer, som tjener som "fangende" reagenser.

2. De undersøgte lymfoide celler tilsættes, dyrkes i flere timer ved 37°C, hvilket giver dem mulighed for at indtage et bestemt sted og udføre en sekretorisk funktion. Antistoffer eller antigener udskilt af sådanne celler fanges af reagenser adsorberet på den faste fase.

3. Celler fjernes under anvendelse af en vaskeopløsning med et cellelyserende detergent.

4. Steder for akkumulering af sekretoriske produkter vises ved at tilføje antistoffer forbundet med enzymet (antiglobulinreagens).

5. Substrat-agaroseblanding tilsættes (brugte substrater bør opløses i agarose og danne uopløselige reaktionsprodukter), brune eller blå pletter dannes på overfladen af ​​den faste fase (afhængigt af de anvendte enzymer og substrater), hvilket afslører områderne, hvor cellerne blev lokaliseret.

De resulterende pletter tælles under et mikroskop, dette vil være antallet af udskillende celler.

En nitrocellulosemembran kan bruges som fast fase.I dette tilfælde er der en række fordele: På grund af NCM's høje adsorptionskapacitet kræves der en væsentlig mindre mængde antigen, der bruges som "fangereagens", derudover. der er ingen grund til at inkludere agarose i substratet.

Ved samtidig at bestemme antallet af udskillende celler og den totale mængde af udskilt antigen eller antistof i brønden, hvilket er muligt ved anvendelse af et andet substrat, er det muligt at bestemme mængden af ​​udskilt stof af en enkelt celle.

Denne metode har fundet bred anvendelse til at vurdere antallet af celler, der udskiller antigenet fanget af adsorberede antistoffer, den bruges til at bestemme antallet af celler, der udskiller cytokiner (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Ved anvendelse af højaffinitetsantistoffer er sensitiviteten af ​​individuelle ELISA-varianter meget høj og gør det teoretisk muligt at påvise enkelte antigenmolekyler, men i praksis er følsomheden begrænset af en række faktorer: enzymaktivitet, signalintensitet og signalregnskabsmetoder. . Signalforstærkningssystemer gør det muligt at øge følsomheden af ​​forskellige ELISA-varianter. Overvej nogle af disse systemer:

Baseret på interaktionen af ​​avidin-biotin.

Biotin-coenzymmolekyler (m.m. 244 Da) er konjugeret med antistoffer ved anvendelse af biotinyl-N-hydroxysuccimid. Et lille biotinmolekyle er lettere at binde til et immunoglobulin eller andet protein uden at krænke dets immun- eller enzymegenskaber. Enzymet er i dette tilfælde bundet til æggehvide-glykoproteinet avidin. Bindingsaffiniteten af ​​avidin til biotin er meget høj (dissociationskonstanten for komplekset er 10-15 mol), avidin-enzymkonjugatet er fast fikseret på antigen-antistof-biotin-komplekset. Efter tilsætning af det passende substrat bestemmes reaktionsproduktet spektrofotometrisk eller ved luminescensintensitet.

Et avidinmolekyle består af fire identiske underenheder, er i stand til at interagere med fire biotinmolekyler, hvilket gør det muligt at bruge det som et bindende molekyle mellem to biotinholdige forbindelser. I dette tilfælde er enzymet også biotinyleret, og avidin fungerer som en bro, der forbinder to molekyler, der indeholder biotinrester. Frit avidin tilsættes til det resulterende antigen-antistof-biotin-kompleks efterfulgt af det biotinylerede enzym. Optag reaktionen.

Avidinproteinet kan sorberes uspecifikt på andre molekyler; derfor bliver et andet biotinbindende protein, streptavidin, der findes i bakterien Streptomyces avidinii, i stigende grad brugt. Streptavidin danner også et stærkt kompleks med biotin og består af fire identiske underenheder.

Anvendelsen af ​​avidin-biotin-komplekset gør det muligt at øge følsomheden af ​​ELISA betydeligt, da snesevis af biotinmolekyler kan bindes til et AT-molekyle under syntesen af ​​et konjugat. At opnå konjugater (antistoffer og enzymer med biotin) er ret let og er ledsaget af minimale ændringer i deres immunologiske og enzymatiske aktivitet. Konjugater af enzymer med biotin kan bruges som universelle reagenser.

Brug af kemiluminescerende reaktioner.

Kemiluminescerende reaktioner kan bruges til at opnå et signal i ELISA, samtidig med at følsomheden af ​​metoden øges og analysetiden reduceres. Peberrodsperoxidase er meget brugt som et mærke i ELISA, og forskellige kemiluminescerende reaktioner kan også bruges til at påvise det. Kemiluminescerende reaktioner er baseret på luminols evne til at gløde, når det oxideres med hydrogenperoxid. Ved direkte analyse producerer en enzymatisk reaktion hydrogenperoxid og oxiderer luminol; denne reaktion katalyseres af peberrodsperoxidase. For at forstærke signalet anvendes forskellige forbindelser, for eksempel luciferin, phenoler, i dette tilfælde øges luminescensintensiteten med 10-100 gange, i nogle tilfælde med 500 gange (forbedret kemiluminescensanalyse). Det luminescerende signal er meget stabilt, dets niveau når et maksimum på 30 s (til sammenligning: farvereaktionen med OPD som indikator udvikler sig kun fuldt ud efter 30 minutter).

Ved indirekte analyse med luminol eller dets derivater mærkes antistoffet. Et sådant mærke i fri tilstand er i stand til at blive oxideret af hydrogenperoxid med frigivelse af lys. Hvis det har dannet et kompleks, mister det sin evne til at oxidere.

Baseret på kaskadesystemer.

For at øge følsomheden af ​​ELISA kan enzymkaskadesystemer anvendes. I dette tilfælde resulterer det første antistofbundne enzym i et reducerbart substrat for det andet enzymsystem. Det andet enzymsystem kan være substratcyklisk eller redoxycyklisk. I dette tilfælde kan phospho-glucoisomerase, aldolase, alkalisk phosphatase tjene som enzymmærker. Det endelige reaktionsprodukt bestemmes visuelt eller spektrofotometrisk.

ELISA amplifikationssystemer opnår høj følsomhed. Sådanne ELISA-systemer bruges til at bestemme niveauet af hormoner (skjoldbruskkirtelstimulerende, progesteron osv.).

ELISA har fundet bred anvendelse inden for forskellige områder af medicin og biologi på grund af metodens relative enkelhed og høje følsomhed. ELISA er med succes blevet brugt til:

Massediagnostik af infektionssygdomme (påvisning af forskellige specifikke antigener eller antistoffer mod dem);

Påvisning og bestemmelse af niveauet af hormoner og lægemidler i biologiske prøver;

Isotypebestemmelser (IgG, IgM og andre) af antistoffer mod et specifikt antigen;

Påvisning af immunkomplekser;

Påvisning af tumormarkører;

Bestemmelse af blodserumproteiner (ferritin, fibronectin osv.);

Bestemmelse af total IgE og specifikke IgE antistoffer;

Screening for myoklonale antistoffer;

Definitioner af cytokiner i biologiske væsker.

Metodefølsomhed

ELISA har erstattet de metoder til agglutination, udfældning og RIA, der tidligere er blevet brugt i klinisk praksis. Sammenlignet med ovenstående metoder er ELISA mindre besværlig og mindre tidskrævende, praktisk til at udføre et stort antal af den samme type analyse.

ELISA kombinerer den unikke specificitet af et immunokemisk assay med den høje følsomhed af enzymmærkning. Metodens følsomhed (under følsomhed betyder den mindste påviselige mængde af antistoffer eller antigen) bestemmes af følgende faktorer: affiniteten af ​​antistoffer, brugen af ​​monoklonale antistoffer er at foretrække; specifik aktivitet af enzymet; signalintensitet; signalfølsomhed. Forskellige ELISA-varianter adskiller sig i deres følsomhed. Separate varianter af fastfase ELISA gør det muligt at påvise enkelte molekyler i en prøve. Den gennemsnitlige følsomhed af ELISA er 10-9 - 10-12 mol.

Galaktionov V.G. Immunologi. Moscow University Press, 1998

Kishkun A.A. Immunologiske undersøgelser og metoder til diagnosticering af infektionssygdomme i klinisk praksis. Medical News Agency, 2009

Kondratieva I.A. Workshop om immunologi. Lærebog for gymnasier. Akademiet, 2004

Lefkovits I., Pernis B. Immunologiske forskningsmetoder. Fred, 1988

Roit A, Brostoff D, Meil ​​D. Immunology. Fred, 2000

Sokolov E.I. Klinisk immunologi. Medicin, 1998

Frimel G. Immunologiske metoder. Medicin, 1987

Khaitov R. M. Immunologi. Medicin, 2000

Shigina Yu.V. Immunologi: Lærebog. RIOR forlag, 2007

Yarilin A.A. Grundlæggende om immunologi. Medicin, 1999

Når en analyse er ordineret, skal du tage en ELISA-test for syfilis. Metoder til laboratoriediagnostik. Analyseresultater - hvordan bestemmes normen og afvigelser. Prisen for enzymimmunoassay.

Som regel ordinerer læger konstant, når de kontakter klinikken, forskellige tests. Dette giver dem mulighed for at identificere infektioner og sygdomme, som en person lider af. ELISA, eller det såkaldte enzymimmunoassay, er en glimrende måde at vurdere kroppens immunsystem på og til at identificere infektion og sygdomsstadium ved tilstedeværelsen af ​​antistoffer.

Så hvem er tildelt til at tage denne analyse, og hvad er en enzymimmunoassay? Læger ordinerer denne analyse, hvis en person har følgende sygdomme:

• Udslæt på kroppen - allergiske reaktioner.
• Vira - herpes, cytomegalavirus.
• Seksuelt overførte sygdomme - syfilis, Trichomonas.
• Patologi forbundet med kræft.
• Neurosyfilis.

Ud over disse sygdomme er analysen ordineret for at bestemme niveauet af hormonet i blodet. Ud fra resultaterne vurderes kvaliteten af ​​terapien. Hvad er syfilis sandsynligvis enhver person ved, men repræsenterer ikke dens omfang, og hvor mange inficerede mennesker går ved siden af ​​os.

I øjeblikket er syfilis den mest almindelige sygdom. Dette er et treponom, der påvirker den menneskelige krop. Og som et resultat påvirkes alle patientens indre organer.

Dette er en meget farlig infektion, og det sker ofte, at den måske ikke viser sig i lang tid. Derfor kan en person være transportør og distributør i lang tid uden at vide, at han er syg.

Metode til laboratoriediagnostik

Medicin står ikke stille, moderne analyser er blevet væsentligt forskellige fra de gamle metoder til at studere kroppen. Selvom de udførte deres rolle perfekt, måtte de nogle gange vente uger og måneder på resultater. Dette var naturligvis ikke gunstigt for den inficerede person. Hvad er forventningen til resultatet, gennemgik den syge.

Klassiske analyser - påvisning af syfilis ved Wasserman-metoden, Kahn-metoden begyndte at miste deres positioner og blev erstattet af sådanne test som ELISA.

Dette er den mest moderne metode til at påvise infektion hos mennesker. Resultatet dekrypteres ved hjælp af en computer. Dette giver dig mulighed for mere præcist at bestemme et positivt resultat eller en negativ test.

Under afkodningen udføres en søgning efter antistoffer mod specifikke sygdomme. Og som et resultat af analysen var det muligt at opdage smitte, når resultatet var positivt. Brug af ELISA til at påvise syfilis indebærer en tre-klasses anvendelse af immunglobuliner:

• G, M, A - for diagnose er de vigtigste.
• De produceres i en inficeret person strengt i en bestemt rækkefølge.
• Bestem hurtigt infektionsstadiet.

ELISA resultater - normal og positiv analyse

Hvis han taler om analysen af ​​ELISA for syfilis, så er det i dette tilfælde svært at sige, at der er en norm eller en afvigelse. Resultatet er normalt enten negativt eller positivt. Derudover er der titere, der bestemmer mængden af ​​antistoffer i blodet.

Der er mange finesser i at dechifrere analysen, hvis den viste et positivt resultat, skal analysen stadig tages flere gange for at udelukke metoden til en falsk positiv reaktion.

Som allerede skrevet er der mange finesser ved dechifrering af analysen, og kun den behandlende læge kan bestemme resultatet. Vi giver eksempler i tabellen, hvilke resultater kan vises for enzymimmunoassay:

Fortvivl ikke, hvis analysen viste et positivt resultat. Som regel udføres yderligere tests og tests på forskellige måder for mere præcist at fastslå diagnosen.

Prisen for enzymimmunoassay

Som regel afhænger omkostningerne ved denne analyse direkte af selve analysen og identifikation af en specifik infektion. Bestemmelse af markører for infektion af forskellige typer koster fra 200 til 350 rubler. Og en sådan analyse udføres inden for to dage.

ELISA er den mest populære og moderne metode til at diagnosticere en organisme. Metoden har vist sin effektivitet til at opdage infektion og bestemme den nøjagtige infektionsperiode.

I betragtning af prispolitikken kan vi sige, at analysen er tilgængelig for enhver person med ethvert budget. Det giver den behandlende læge mulighed for at få et komplet billede af en persons infektion. Han viste sig i sagen og skuffede ikke lægerne. På samme tid, efter at have modtaget en analyse, kunne den behandlende læge reagere hurtigt og ordinere rettidig behandling.

Enzymimmunoassay er en af ​​de vigtigste undersøgelser udført for at vurdere den menneskelige krops evne til at modstå angreb af patogener. Det giver dig mulighed for at forstå, hvor godt immunsystemet håndterer smitsomme processer. Dette gør det til gengæld muligt at justere behandlingsregimet, hvis der er nogen.

Og dette er langt fra alle funktionerne i denne test, så lad os se nærmere på spørgsmålene om, hvad en ELISA-analyse er, hvem den vises til, hvordan den udføres, og hvad de opnåede data kan sige.

Hvad er denne undersøgelse

Så hvad er det her - ELISA-analyse? Denne forkortelse står for "enzymatisk immunoassay". Det udføres i tilfælde af, at det er nødvendigt at bestemme tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod forskellige slags antigener.

Antigener er sygdomsfremkaldende midler, der bidrager til udviklingen af ​​forskellige patologier. Antistoffer er stoffer, der er nødvendige for at ødelægge fremmede celler.

Blodimmunoassayet er rettet mod at bestemme niveauerne af immunglobuliner, der kan kombineres til immunkomplekser. De produceres aktivt af immunsystemet som reaktion på indførelsen af ​​antigener i kroppen.

Bemærk. For at bekæmpe hver enkelt type antigen produceres dets egne specifikke antistoffer. Dette er det, der hjælper med at identificere sygdommen, og endda dens stadie, ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assay.

Når et fremmed antigen kommer ind i menneskekroppen, "binder" antistoffer sig til det, hvorefter de neutraliserer dets virkning. Dette sker på grund af enzymatisk lysis og fagocytose reaktioner. Gennem denne proces fjernes antigener fra blodet.

Hvornår er testen planlagt?

Efter at have forstået, hvad et enzymbundet immunosorbent-assay er, vil vi forstå de situationer, hvor det viser sig at blive udført. Så forskning er nødvendig, når:

• onkologiske sygdomme;
• viral hepatitis;
• herpetiske udbrud på huden eller slimhinderne;
• salmonellose;
• mæslinger;
• encephalitis;
• syfilis;
• dysenteri;
• atopisk dermatitis eller atypiske manifestationer af allergiske reaktioner.

Derudover bruges ELISA-metoden til at identificere og identificere patogener:

• seksuelt overførte sygdomme;
• cytomegalovirusinfektion;
• helminthiaser.

Enzyme immunoassay er en undersøgelse, der hjælper med at bestemme arten af ​​endokrine sygdomme, samt identificere tilstedeværelsen af ​​immundefekt og infertilitet hos mænd og kvinder. Med dens hjælp laves prognoser for det videre forløb af hjerteanfald, slagtilfælde, neurologiske og nyresygdomme.

ELISA-analyse udføres også i forebyggende øjemed. Sørg for at udføre det under graviditeten, såvel som patienter, der tidligere har gennemgået ovennævnte sygdomme. Personer med risiko for at udvikle de tidligere nævnte sygdomme donerer også regelmæssigt blod til ELISA.

Funktioner af testen og afkodningen

I de fleste tilfælde tages patientens blod til enzymimmunoassay. Men under visse omstændigheder kan væv tages fra overfladen af ​​glaslegemet. Hos gravide kvinder kan ELISA-diagnose udføres ved at studere sammensætningen af ​​fostervand.

Blodprøvetagning udføres ved hjælp af en sprøjte, mens materialet til forskning som regel tages fra en vene placeret på indersiden af ​​albuebøjningen. Patienten skal være i en afslappet tilstand i siddende stilling.

Vigtig! Resultaterne af testen, dens fortolkning og fortolkningen af ​​dataene afhænger af metoden for den diagnostiske manipulation og det anvendte udstyr. Som regel angiver hvert laboratorium på formularen normen for immunoglobulinindikatorer.

Funktioner af forberedelse

En blodprøve for ELISA kræver, at visse forberedende procedurer udføres:

• springe morgenmaden over på prøvedagen;
• seponering af blodfortyndende medicin og andre farmakologiske midler, der kan påvirke resultaterne (efter forudgående konsultation med din læge);
• afholdenhed fra rygning på undersøgelsesdagen;
• nægte at drikke alkohol dagen før blodprøvetagning;
• udelukkelse af brugen af ​​narkotiske stoffer (herunder medicin, der indeholder dem).

Overholdelse af sådanne regler for forberedelse af en immunokemisk blodprøve eliminerer muligheden for dataforvrængning.

Fortolkning af data

Resultaterne af undersøgelsen gives til patienten i hans hænder, hvorefter han gennemgår en anden konsultation med en specialist. Fortolkningen af ​​ELISA-data kan være positiv eller negativ. I dette tilfælde tages der også hensyn til tallene, der angiver (hvis nogen).

Hvis ELISA er negativ, kan dette indikere fraværet af patologiske processer eller den indledende fase af deres udvikling. Også et "negativt" resultat af undersøgelsen observeres, når patienten kommer sig efter terapiforløbet. Men sådanne data kan kun opnås efter en vis periode (1 - 2 måneder).

Hvis der ikke er IgM i blodet, og IF-analysen viste et positivt resultat for, kan det tyde på, at patienten har udviklet en stærk immunitet over for en bestemt type antigen. Dette er, hvad der sker med immunisering.

Med en høj koncentration af IgM på baggrund af fraværet af IgG og IgA kan vi tale om en inflammatorisk proces, der opstår i den akutte fase.

Hvad betyder det, hvis ELISA er positiv for alle typer immunglobuliner? I sådanne tilfælde kan vi tale om gentagelsen af ​​en infektiøs patologi. I dette tilfælde fikseres udseendet af antistoffer kun i den akutte fase af en kronisk sygdom.

Når sygdommen går ind i svækkelsesfasen, vil den være negativ. Men ELISA for IgG og IgA vil være positiv.

Fordele og ulemper ved testen

Undersøgelsen af ​​blod ved ELISA har sine styrker og svagheder. Fordelene omfatter:

• relativt lave omkostninger;
• nøjagtighed;
• muligheden for regelmæssig adfærd for at vurdere effektiviteten af ​​behandlingen;
• hastighed af udførelse;
• brugen af ​​højpræcision og meget informativ teknologi for at opnå pålidelige resultater;
• muligheden for at udføre flere undersøgelser inden for det samme fokus for den patologiske proces;
• absolut smertefrihed;
• fravær af nogen risiko for patientens helbred;
• relativ let at studere.

ELISA blodprøve, på grund af fordelene beskrevet ovenfor, er blevet udbredt og spiller en vigtig rolle i diagnosticering af forskellige sygdomme.

Fejl

En væsentlig ulempe ved blod ELISA er sandsynligheden for at opnå falsk positive eller falsk negative resultater. Men i de fleste tilfælde skyldes det ikke selve forskningsmetoden, men den menneskelige faktor.

En anden nuance, der kan påvirke de endelige data, er den medicin, der bruges under testen. Hvis de bruges forkert, eller i tilfælde af ægteskab, vil afkodningen af ​​ELISA-analyserne være upålidelig. Derfor skal undersøgelsen gentages.

Vigtig! En krænkelse af metaboliske processer i patientens krop kan påvirke testdataene. Derudover kan resultaterne blive påvirket af tilstedeværelsen af ​​flere foci af infektionssygdomme (kroniske!) på én gang.

En ELISA-blodprøve udføres for at identificere:

• ascariasis;
• opisthorchiasis - akut eller kronisk;
• giardiasis;
• toxoplasmose.

Under undersøgelsen kan der også findes pinworms eller amøbe i patientens krop. Diagnosen "leishmaniasis" og "trichinosis" stilles også ofte til patienter på basis af ELISA-blodprøvedata.

Opsummering

Det er selvfølgelig meget svært at forstå testdataene på egen hånd, da der skal tages højde for mange faktorer under denne proces. Dårlige vaner, tilstedeværelsen af ​​samtidige sygdomme, brugen af ​​visse grupper af medicin - alt dette spiller en vigtig rolle og kan påvirke resultaterne, som tages i betragtning af læger, når de dechiffrerer resultaterne af ELISA.

Men "informeret betyder bevæbnet", derfor er det vigtigt for hver person at kende funktionerne ved at udføre og fortolke dataene fra de laboratorietests, som den behandlende læge ordinerer til ham. Og ELISA-metoden er ingen undtagelse!

Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) udføres for en omfattende vurdering af kroppens beskyttende funktioner. Under undersøgelsen bestemmes antallet og egenskaberne af immunceller, tilstedeværelsen af ​​de nødvendige antistoffer. ELISA blodprøve udføres for at diagnosticere infektionssygdomme, hæmatologiske, autoimmune sygdomme, primære og sekundære immundefekter. Overvej, hvad en blodprøve er ved ELISA, og hvilke indikationer der findes for denne undersøgelse.

Hvad er det

En ELISA-blodprøve er en laboratoriemetode, der påviser antistoffer eller antigener i en blodprøve. Denne undersøgelse bruges til at påvise niveauet af immunglobuliner, immunologiske komplekser, hormoner.

Indikationer for analyse

For udnævnelsen af ​​en ELISA-blodprøve er der følgende indikationer:

• diagnose af seksuelt overførte infektioner - ureaplasma, mycoplasma, klamydia, trichomonas, syfilis;
• diagnose af virussygdomme - cytomegalovirus, herpes, hepatitis, Epstein-Barr-virus;
• bestemmelse af niveauet af hormoner;
• diagnose af onkologiske sygdomme;
• bestemmelse af immundefekt;
• diagnosticering af allergier;
• præoperativ omfattende undersøgelse før organtransplantation;
• vurdering af terapiens effektivitet.

Metodeprincip

Funktionsprincippet for enzymimmunoassay-metoden er baseret på bestemmelse af specifikke protein-antistoffer i blodet - immunoglobuliner. Immunglobuliner produceres af det menneskelige immunsystem, når antigener (fremmede mikroorganismer) kommer ind i kroppen. Disse immunmolekyler binder sig til en række smitsomme stoffer i kroppen og neutraliserer dem.

Immunoglobuliner har en vigtig egenskab - specificitet. På grund af dette kan de binde sig til et specifikt antigen og danne et antigen-antistofkompleks. Under en ELISA-blodprøve er det dette kompleks, der bestemmes kvalitativt og kvantitativt.

Der er fem klasser af immunglobuliner. Men normalt defineres tre klasser - immunglobuliner A, M, G. Disse antistoffer akkumuleres i kroppen på forskellige tidspunkter fra infektionsøjeblikket.

• Immunoglobuliner klasse M (IgM) vises i blodet allerførst på den femte dag fra infektionsøjeblikket. De er i kroppen i 5-6 uger, for derefter at forsvinde fra blodbanen. IgM-antistoffer indikerer en akut periode af sygdommen eller en forværring af sygdommen i dets kroniske forløb.
• Cirka 3-4 uger efter infektion opstår immunglobuliner i blodet klasse G (IgG). De kan eksistere i menneskeblod i flere måneder eller endda år. Ifølge afkodningen af ​​ELISA-blodprøven, hvis mængden af ​​IgG-immunoglobuliner øges i to blodprøver taget efter hinanden to uger senere, taler de om en aktuel infektion eller geninfektion - geninfektion med den samme infektion.
• Immunoglobuliner klasse A (IgA) kan påvises ved denne forskningsmetode 2-4 uger efter infektion eller forværring af en infektionssygdom. Heraf cirkulerer kun 20 % i blodet, resten udskilles af slimhinderne. IgA-antistoffer forsvinder fra blodbanen 2-8 uger efter ødelæggelsen af ​​smitstoffer. Forsvinden af ​​disse immunglobuliner betyder en kur mod infektionen. Hvis der efter sygdommens afslutning bestemmes tilstedeværelsen af ​​IgA-antistoffer i blodet, er sygdommen gået over i det kroniske stadium.

Forberedelse til analyse

Menneskeblod bruges oftest til at udføre en ELISA-blodprøve. Men du kan også undersøge indholdet af glaslegemet, cerebrospinalvæske, fostervand.

En blodprøve til forskning tages fra patienten fra cubitalvenen. Det anbefales at donere blod på tom mave (mindst 12 timer bør gå fra det tidspunkt, hvor det sidste måltid blev taget). Det er nødvendigt at fortælle lægen, hvis patienten tager medicin, da nogle af dem kan ændre resultatet af analysen. Pålideligheden af ​​undersøgelsens resultater påvirkes af brugen af ​​alkohol og stoffer.

Dekryptering

Resultatformen af ​​denne analyse indikerer et positivt (+) eller negativt (-) resultat for hver klasse af immunglobuliner.

Overvej fortolkningen af ​​en mulig afkodning af ELISA-blodprøven.

• Negativt resultat af IgM, IgG, IgA - mangel på immunitet mod infektion.
• Negativt IgM, IgA og positivt IgG resultat - post-infektion eller post-vaccination immunitet.
• Negativt eller positivt IgG, IgA og positivt IgM er en akut infektion.
• Et positivt resultat af IgM, IgG, IgA er en forværring af en kronisk infektionssygdom.
• Et negativt IgM-resultat og et negativt eller positivt IgG, IgA-resultat er en kronisk infektion.
• Negativt IgM-resultat og ingen IgG, IgA - opsving.

Fordele ved metoden

En ELISA blodprøve har mange fordele. De vigtigste kan skelnes:

• relativt høj nøjagtighed (følsomhed);
• muligheden for tidlig diagnose;
• evnen til at spore dynamikken i den infektiøse proces;
• et højt niveau af forening, som giver mulighed for masseundersøgelser;
• en kort periode, der kræves for at opnå resultatet af analysen;
• bekvemmelighed i arbejdet;
• automatisering af alle stadier af analyse;
• relativt lave omkostninger.

Fejl

Ulempen ved ELISA-metoden er, at den nogle gange giver falsk negative eller falsk positive resultater. Ud over tekniske fejl under undersøgelsen kan årsagen til falske resultater være reumatoidfaktoren hos patienten, tilstedeværelsen af ​​kroniske sygdomme (hvor der produceres antistoffer), stofskifteforstyrrelser og indtagelse af visse lægemidler.

• ascariasis;
• trikinose - analysen udføres flere gange, det maksimale niveau af antistoffer bestemmes 4-12 uger efter infektion;
• cysticercosis;
• taeniasis;
• fascioliasis - antistoffer bestemmes i det akutte stadium af sygdommen;
• opisthorchiasis - udføre differentialdiagnose mellem kroniske og akutte former for sygdommen;
• giardiasis;
• visceral og kutan leishmaniasis;
• amøbiasis;
• toxoplasmose.

4.2 4,20 ud af 5 (5 stemmer)

ELISA-analyse er en moderne teknik til laboratoriediagnostik af et betydeligt antal forskellige sygdomme. Forkortelsen står for enzymimmunoassay. Essensen af ​​teknikken er at bestemme titeren (aktiviteten) af antistoffer.

ELISA-teknikken vinder betydelig popularitet i dag. Det bruges i klinisk medicin til diagnosticering af forskellige patologier såvel som i eksperimentelle undersøgelser, der kræver nøjagtig bestemmelse af koncentrationen af ​​forskellige forbindelser i de undersøgte medier.

Princippet i ELISA-teknikken

ELISA er en immunologisk reaktion. Det er baseret på tilsætning af specifikke antistoffer
eller antigener ind i testmediet (oftest testblodet) med efterfølgende enzymatisk bestemmelse af koncentrationen af ​​de resulterende antigen-antistofkomplekser. Ved koncentrationen af ​​komplekset kan man bedømme niveauet eller aktiviteten af ​​analytten i testmediet.

Bestemmelse af koncentrationen af ​​antigen-antistofkomplekser udføres sædvanligvis ved hjælp af specialudstyr ved den kromatografiske metode.

Indikationer for udførelse

ELISA-analyse udføres for forskellige indikationer, de vigtigste inden for klinisk medicin er:

• Diagnose af infektiøs patologi med en overvejende seksuel overførsel (STI), som omfatter klamydia, mycoplasmose, ureaplasmose, trichomoniasis, mens specifikke antistoffer mod smitstoffet påvises.
• Diagnose af infektionssygdomme af forskellig lokalisering for at bestemme stadiet af den patologiske proces, primært i processen med at diagnosticere parenteral viral hepatitis og HIV.
• Bestemmelse af koncentrationen af ​​hormoner til diagnosticering af forskellige patologier i organerne i det endokrine system (endokrine kirtler).
• Bestemmelse af forskellige forbindelser til diagnosticering af årsagen til forgiftning af kroppen i tilfælde af forgiftning, insekt- eller slangebid.

Med disse medicinske indikationer udføres en ELISA-blodprøve. Også denne teknik bruges aktivt i eksperimentel medicin under forskellige kliniske undersøgelser under udviklingen af ​​nye lægemidler, vacciner til immunprofylakse.

Hvordan undersøgelsen foregår

En ELISA-blodprøve udføres i et specialiseret laboratorium. Tidligere, til dens gennemførelse, tages venøst ​​blod, normalt fra cubitalvenen i et volumen på 5-10 ml, som derefter sendes til laboratoriet. I gennemsnit kan resultatet af analysen opnås allerede den næste dag, hvilket er et vigtigt punkt for hurtig udnævnelse af behandling efter diagnosen af ​​sygdommen er etableret.

Sådan forbereder du dig til ELISA

For at opnå pålidelige resultater af undersøgelsen ved hjælp af enzymimmunoassay bør du følge et par enkle forberedende anbefalinger, som omfatter:

• Dagen før testen bør du stoppe med at spise fed mad (kød, røget kød) og alkohol.
• Materiale til forskning skal tages om morgenen på tom mave.
• På studiedagen er det ønskeligt at undgå fysisk og psyko-emotionel stress.
• Før undersøgelsen skal du forsøge ikke at ryge.

De fleste af de opnåede falske positive resultater af enzymimmunoassayet skyldes ukorrekt implementering af de forberedende anbefalinger. Dette er i de fleste tilfælde forbundet med at spise fed mad, som fører til en stigning i koncentrationen af ​​triglycerider (fedtstoffer) i blodplasmaet, som reducerer specificiteten af ​​ELISA.

Dechifrering af resultaterne

Blodprøven for antistoffer ved hjælp af ELISA har 2 modifikationer - kvalitativ og kvantitativ bestemmelse. På
kvalitativ bestemmelse af antistoffer, resultatet kan være positivt (antistoffer påvises, hvilket indikerer den mulige tilstedeværelse af en patologisk proces forårsaget af det smitsomme middel) eller negativt (der er ingen antistoffer, hvilket indikerer fraværet af en infektiøs proces).

Fraværet af antistoffer er ikke altid en 100 % indikator for fraværet af en infektiøs proces. Dette skyldes, at der efter infektion ikke dannes antistoffer med det samme, men over en vis periode (mindst ca. 2 uger). Derfor kan ELISA gentages efter et stykke tid for at bekræfte fraværet af infektion.

Med kvantitativ ELISA bestemmes antistoffernes titer (aktivitet) såvel som deres klasser. I de fleste tilfælde, til diagnosticering af infektionssygdomme, bestemmes antistoffer af IgG-klassen (immunoglobuliner G) og IgM (immunoglobuliner M), som dannes i kroppen med forskellige intervaller efter infektion, så dechifrering af analysens resultat kan have flere betydninger:

• En stigning i IgM-aktivitet og fravær af IgG er tegn på en nylig infektion og et akut forløb af den infektiøse proces.
• En stigning i aktiviteten af ​​IgM og IgG er en forværring af den infektiøse proces i dets kroniske forløb og langvarige infektion.
• Høj aktivitet af IgG og fravær af IgM er et kronisk forløb af den infektiøse proces på baggrund af en langvarig infektion, hvorefter der er gået mere end seks måneder (den tid, der kræves for dannelsen af ​​IgG-klasse antistoffer).

Generelt har fortolkningen af ​​resultaterne af ELISA for hver infektiøs proces visse funktioner. En mere nøjagtig bestemmelse af tilstedeværelsen af ​​en infektionssygdom såvel som stadiet af dens forløb udføres af en læge.

ELISA er i øjeblikket den foretrukne metode til diagnosticering af de fleste infektionssygdomme. Baseret på resultaterne af en sådan undersøgelse har lægen mulighed for at etablere en nøjagtig diagnose og bestemme stadiet af forløbet af den patologiske proces for at ordinere den efterfølgende passende og effektive behandling.