Laboratorijska dijagnostika gotovo svih zaraznih bolesti temelji se na otkrivanju antitijela u krvi pacijenta, koja se stvaraju protiv antigena uzročnika, metodama seroloških reakcija. U medicinsku praksu ušli su od kraja devetnaestog do početka dvadesetog vijeka.

Razvoj nauke pomogao je da se utvrdi antigena struktura mikroba i hemijske formule njihovih toksina. To je omogućilo stvaranje ne samo terapijskih, već i dijagnostičkih seruma. Dobivaju se primjenom atenuiranih patogena laboratorijskim životinjama. Nakon nekoliko dana izlaganja, od krvi zečeva ili miševa pripremaju se preparati koji serološkim testovima koriste za identifikaciju mikroba ili njihovih toksina.

Vanjska manifestacija takve reakcije ovisi o uvjetima njenog nastanka i o stanju antigena u krvi pacijenta. Ako su mikrobne čestice netopive, one se talože, liziraju, vežu ili imobiliziraju u serumu. Ako su antigeni topljivi, javlja se fenomen neutralizacije ili precipitacije.

Reakcija aglutinacije (RA)

Serološka reakcija aglutinacije je vrlo specifična. Jednostavan je za izvođenje i dovoljno vizualan da brzo utvrdi prisustvo antigena u krvnom serumu pacijenta. Koristi se za stadijum Vidalove reakcije (dijagnoza trbušnog tifusa i paratifusa) i Weiglove (tifusne groznice).

Zasniva se na specifičnoj interakciji između ljudskih antitijela (ili aglutinina) i mikrobnih ćelija (aglutenogena). Nakon njihove interakcije nastaju čestice koje se talože. Ovo je pozitivan znak. Živi ili ubijeni mikrobni agensi, gljive, protozoe i somatske ćelije mogu se koristiti za uspostavljanje reakcije.

Hemijski, reakcija je podijeljena u dvije faze:

1. Specifična veza antitela (AT) sa antigenima (AG).
2. Nespecifični - precipitacija AG-AT konglomerata, odnosno stvaranje aglutinata.

Indirektna reakcija aglutinacije (IPHA)

Za njegovo postavljanje koriste se pročišćeni ovčiji eritrociti i ljudska crvena krvna zrnca, prethodno tretirana antitijelima ili antigenima (ovisi šta tačno laboratorijski asistent želi pronaći). U nekim slučajevima, ljudska crvena krvna zrnca se liječe imunoglobulinima. Smatra se da je došlo do seroloških reakcija eritrocita ako su se taložili na dnu epruvete. O pozitivnoj reakciji možemo govoriti kada su ćelije raspoređene u obliku obrnutog kišobrana, koji zauzima cijelo dno. Negativna reakcija se računa ako su se eritrociti smjestili u stupac ili u obliku dugmeta u sredini dna.

Reakcija precipitacije (RP)

Serološki testovi ovog tipa koriste se za otkrivanje ekstremno malih čestica antigena. To mogu biti, na primjer, proteini (ili njihovi dijelovi), spojevi proteina s lipidima ili ugljikohidratima, dijelovi bakterija, njihovi toksini.

Serumi za reakciju se dobivaju umjetnom infekcijom životinja, obično zečeva. Ovom metodom možete dobiti apsolutno bilo koji precipitirajući serum. Postavka seroloških reakcija precipitacije je po mehanizmu djelovanja slična reakcijama aglutinacije. Antitijela sadržana u serumu kombinuju se s antigenima i formiraju velike proteinske molekule koje se talože na dnu epruvete ili na supstratu (gelu). Ova metoda se smatra vrlo specifičnom i može otkriti čak i zanemarljive količine tvari.

Koristi se za dijagnostiku kuge, tularemije, antraksa, meningitisa i drugih bolesti. Osim toga, on je uključen u sudsko-medicinski pregled.

u gelu

Serološke reakcije se mogu izvesti ne samo u tečnom mediju, već iu agar gelu. Ovo se zove metoda difuzne precipitacije. Uz njegovu pomoć proučava se sastav složenih antigenskih mješavina. Ova metoda se zasniva na hemotaksiji antigena na antitijela i obrnuto. U gelu se kreću jedni prema drugima različitim brzinama i, susrećući se, formiraju linije padavina. Svaka linija je jedan set AG-AT.

Reakcija neutralizacije egzotoksina sa antitoksinom (RN)

Antitoksični serumi su u stanju da neutraliziraju djelovanje egzotoksina koji proizvode mikroorganizmi. Ove serološke reakcije se temelje na tome. Mikrobiologija koristi ovu metodu za titriranje seruma, toksina i toksoida i određivanje njihove terapeutske aktivnosti. Snaga neutralizacije toksina određena je konvencionalnim jedinicama - AE.

Osim toga, zahvaljujući ovoj reakciji, moguće je odrediti vrstu ili vrstu egzotoksina. Koristi se za difteriju, botulizam. Studija se može izvesti i "na staklu" i u gelu.

Reakcija lize (RL)

Imuni serum koji ulazi u tijelo pacijenta ima, pored svoje glavne funkcije pasivnog imuniteta, i svojstva lizanja. U stanju je da otopi mikrobne agense, ćelijske strane elemente i viruse koji ulaze u tijelo pacijenta. Ovisno o specifičnosti antitijela uključenih u serum, izdvajaju se bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini i drugi.

Ova specifična antitijela se nazivaju "komplement". Nalazi se u gotovo svim ljudskim tjelesnim tekućinama, ima složenu strukturu proteina i izuzetno je osjetljiv na porast temperature, tresenje, kiseline i direktnu sunčevu svjetlost. Ali u osušenom stanju, može zadržati svoja svojstva lizanja do šest mjeseci.

Postoje takve vrste seroloških reakcija ove vrste:

Bakterioliza;

Hemoliza.

Bakterioliza se provodi korištenjem krvnog seruma pacijenta i specifičnog imunološkog seruma sa živim mikrobima. Ako je u krvi prisutno dovoljno komplementa, tada će istraživač vidjeti kako se bakterija lizira, a reakcija će se smatrati pozitivnom.

Druga serološka reakcija krvi je da se suspenzija eritrocita pacijenta tretira serumom koji sadrži hemolizine, koji se aktiviraju samo u prisustvu određenog komplimenta. Ako postoji, tada laboratorijski asistent promatra otapanje crvenih krvnih zrnaca. Ova reakcija se široko koristi u modernoj medicini za određivanje titra komplementa (odnosno njegove najmanje količine koja izaziva lizu eritrocita) u krvnom serumu i za analizu za fiksaciju komplementa. Na taj način se provodi serološka reakcija na sifilis -

Reakcija fiksacije komplementa (CFR)

Ova reakcija se koristi za otkrivanje antitijela na infektivni agens u krvnom serumu pacijenta, kao i za identifikaciju patogena po njegovoj antigenskoj strukturi.

Do sada smo opisali jednostavne serološke reakcije. RSK se smatra složenom reakcijom, jer u njoj ne djeluju dva, već tri elementa: antitijelo, antigen i komplement. Njegova suština leži u činjenici da se interakcija između antitijela i antigena događa samo u prisustvu proteina komplementa, koji se adsorbiraju na površini formiranog AG-AT kompleksa.

Sami antigeni, nakon dodavanja komplementa, prolaze kroz značajne promjene, što pokazuje kvalitet reakcije. To može biti liza, hemoliza, imobilizacija, baktericidno ili bakteriostatsko djelovanje.

Sama reakcija se odvija u dvije faze:

1. Formiranje kompleksa antigen-antitijelo koje nije vizualno vidljivo ispitivaču.
2. Promjena antigena djelovanjem komplementa. Ova faza se najčešće može pratiti golim okom. Ako reakcija nije vizualno vidljiva, tada se koristi dodatni sistem indikatora za identifikaciju promjena.

sistem indikatora

Ova reakcija se zasniva na fiksaciji komplementa. Pročišćeni ovnski eritrociti i hemolitički serum bez komplementa dodaju se u epruvetu sat vremena nakon postavljanja RSC. Ako nevezani komplement ostane u epruveti, tada će se spojiti s AG-AT kompleksom formiranim između ovčijih krvnih stanica i hemolizina i uzrokovati njihovo rastvaranje. To će značiti da je RSK negativan. Ako su eritrociti ostali netaknuti, tada je reakcija pozitivna.

Reakcija hemaglutinacije (RHA)

Postoje dvije fundamentalno različite reakcije hemaglutinacije. Jedan od njih je serološki, koristi se za određivanje krvnih grupa. U ovom slučaju, eritrociti stupaju u interakciju s antitijelima.

A druga reakcija se ne odnosi na serološke, jer crvena krvna zrnca reagiraju s hemaglutininima koje proizvode virusi. Budući da svaki patogen djeluje samo na specifične eritrocite (piletina, ovca, majmun), ova reakcija se može smatrati visoko specifičnom.

Možete reći da li je reakcija pozitivna ili negativna prema lokaciji krvnih stanica na dnu epruvete. Ako njihov uzorak podsjeća na obrnuti kišobran, tada je željeni virus prisutan u krvi pacijenta. A ako su se svi eritrociti formirali kao novčić, onda nema željenih patogena.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA)

Ovo je vrlo specifična reakcija koja vam omogućava da utvrdite vrstu, vrstu virusa ili prisustvo specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta.

Njegova suština leži u činjenici da antitijela koja se dodaju u epruvetu sa materijalom za ispitivanje sprječavaju taloženje antigena na eritrocitima, čime se zaustavlja hemaglutinacija. Ovo je kvalitativni znak prisutnosti u krvi specifičnih antigena za određeni virus od interesa.

Reakcija imunofluorescencije (RIF)

Reakcija se zasniva na sposobnosti detekcije AG-AT kompleksa nakon njihovog tretmana fluorohromnim bojama. Ova metoda je laka za rukovanje, ne zahtijeva izolaciju čiste kulture i oduzima malo vremena. Neophodan je za brzu dijagnostiku zaraznih bolesti.

U praksi se ove serološke reakcije dijele na dvije vrste: direktne i indirektne.

Direktni RIF se pravi sa antigenom koji je prethodno tretiran fluorescentnim serumom. I indirektno, lijek se prvo tretira konvencionalnim dijagnostikumom koji sadrži antigene za antitijela od interesa, a zatim se ponovo primjenjuje luminiscentni serum, koji je specifičan za proteine ​​AG-AT kompleksa, i mikrobne stanice postaju vidljive pod mikroskopom.

Lekcija 14

Tema: Indirektne serološke reakcije. Reakcije indirektne hemaglutinacije (RNHA), fiksacije komplementa (RSK).

Antitijela

Antitijela su proteinski molekuli sposobni da se specifično vežu za antigene. Antitijela su gama globulini. Drugi naziv za antitijela je imunoglobulin. Kod sisara postoji 5 klasa imunoglobulina koji se razlikuju po svojoj strukturi i nekim svojstvima: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Struktura imunoglobulina. IgG imaju najtipičniju strukturu. Molekul se sastoji od 4 proteinska lanca: dva laka (L) i dva teška (H), koji su međusobno povezani disulfidnim vezama. Mjesto antitijela koje se veže za antigen naziva se aktivno mjesto antitijela. IgG molekul ima 2 aktivna centra. Formiran je od N-terminalnih dijelova teških i lakih lanaca. Područje teških lanaca smješteno u blizini disulfidnih veza naziva se zglobno područje. Uz pomoć enzima papaina, IgG molekul iznad zglobnog regiona se deli na 3 fragmenta: 2 od njih sadrže laki lanac i deo teškog lanca (Fab fragmenti); a treći fragment se sastoji samo od dijela teških lanaca (Fc fragment). Zahvaljujući pokretnoj šarki, Fab fragmenti mogu promijeniti svoj relativni položaj u prostoru.

Aminokiselinske sekvence lakih i teških lanaca dele se na konstantne (konstantne) i varijabilne regione. Varijabilni regioni se nalaze na N-terminusu lakih i teških lanaca (VL i VH). Konstantni regioni se nalaze na C-terminusu lanaca (CL i CH). U lakim i teškim lancima, aminokiselinske sekvence formiraju nekoliko globularnih struktura koje se nazivaju domeni.

Aktivno mjesto antitijela formirano je od varijabilnih domena lakih i teških lanaca i predstavlja šupljinu ( paratop), koji ima određenu konfiguraciju i distribuciju električnih naboja na svojoj površini. Veličina, oblik i distribucija naboja u aktivnom mjestu određuju njegovu specifičnost, odnosno sposobnost vezivanja za specifičnu antigensku determinantu ( epitop), koji ima komplementarnu strukturu.

Antigene determinante su područja koja strše na površini molekula antigena. Stoga se interakcija epitop-paratop odvija po principu “ključ-zaključavanje”.

Snagu veze između aktivnog centra antitijela i antigenske determinante karakterizira koncept afiniteta. afinitet je mjera afiniteta aktivnog mjesta i antigenske determinante.

IgG klase imunoglobulina čine 75% ukupne količine serumskih imunoglobulina. Važno svojstvo IgG je njihova sposobnost da prođu kroz placentu. Dakle, majčina antitijela ulaze u djetetov organizam i štite ga od infekcije u prvim mjesecima života (prirodni pasivni imunitet).

Oko 10% ukupnog skupa imunoglobulina pripada klasi IgM. Molekul IgM je pentamer, odnosno sastoji se od 5 identičnih molekula, po strukturi sličnih IgG molekulu, ima 10 aktivnih centara. Podjedinice su međusobno povezane disulfidnim vezama. IgM molekul ima dodatni J-lanac koji vezuje podjedinice. Antitijela IgM klase ne prolaze kroz placentnu barijeru.

Antitijela IgA klase čine 15-20% ukupnog sadržaja imunoglobulina. IgA molekul se sastoji od 2 laka i 2 teška lanca, ima 2 aktivna centra. U krvnom serumu IgA su prisutni u monomernom obliku, dok su u sekretima sluzokože IgA predstavljeni u obliku dimera i nazivaju se sekretornim ili sIgA, imaju 4 aktivna centra. C-terminali teških lanaca u sIgA molekulu su međusobno povezani J-lancem i proteinskim molekulom koji se naziva sekretorna komponenta. Sekretorna komponenta štiti sIgA od cijepanja proteolitičkim enzimima, koji se u velikim količinama nalaze u sekreciji sluzokože. Glavna funkcija sIgA je zaštita sluznice od infekcije. IgA ne prolazi placentnu barijeru. Visoka koncentracija sIgA nalazi se u majčinom mlijeku žena, posebno u prvim danima laktacije. Oni štite gastrointestinalni trakt novorođenčeta od infekcije.

IgD se uglavnom nalaze na membrani B-limfocita. Imaju strukturu sličnu IgG, 2 aktivna centra. Biološka uloga nije u potpunosti poznata.

IgE - koncentracija ove klase imunoglobulina u krvnom serumu je izuzetno niska. IgE molekuli su uglavnom fiksirani na površini mastocita i bazofila. IgE je po svojoj strukturi sličan IgG, ima 2 aktivna centra. Pretpostavlja se da je IgE bitan u razvoju anthelmintičkog imuniteta. IgE igra važnu ulogu u patogenezi nekih alergijskih bolesti (bronhijalna astma, peludna groznica) i anafilaktičkog šoka.

Indirektna reakcija hemaglutinacije

U indirektnim serološkim reakcijama kompleks antigena s antitijelima nije vidljiv golim okom. U takvim slučajevima antigeni se adsorbuju na većim česticama nosača (eritrociti, čestice lateksa), čime se dobija antigeni eritrocitni dijagnostikum. Naknadna aglutinacija takvih čestica sa specifičnim antitijelima omogućava da se aglutinat (precipitat) vidi golim okom. Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RIHA) otkriva antitijela u krvnom serumu pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, a to su eritrociti na kojima su adsorbirani antigeni.

Eritrociti na kojima su adsorbirani antigeni stupaju u interakciju s odgovarajućim antitijelima u krvnom serumu, što uzrokuje da se eritrociti zalijepe zajedno i ispadnu na dno epruvete ili ćelije u obliku zupčastog sedimenta. Uz negativnu reakciju, eritrociti se talože u obliku gumba.

RNHA se stavlja u plastične tablete ili u epruvete sa razblaženjima krvnog seruma, kojima se dodaje dijagnostikum eritrocita.

Ponekad se koristi eritrocitni dijagnostikum antitijela - eritrociti na kojima se adsorbiraju antitijela. Ova reakcija se naziva RONGA - reverzna reakcija indirektne hemaglutinacije.

RNGA komponente:

Serum krvi pacijenta (razrjeđenje 1:25);

Erythrocyte diagnosticum (eritrociti napunjeni antigenom ispitivanog patogena);

Rastvor za pranje.

RNGA inscenacija. Dvije kapi otopine fosfatnog pufera dodaju se u sedam jažica ploče za imunološke studije. U prvu jažicu se dodaju dvije kapi krvnog seruma pacijenta, nakon čega se 2 kapi prebace iz prve u drugu jažicu, iz druge u treću itd. Iz šeste jažice se uklone 2 kapi. U svih sedam jažica (6 eksperimentalnih i 1 kontrolna) dodajte 2 kapi dijagnostikuma eritrocita. Nakon svake operacije potrebno je isprati pipetu u rastvoru za pranje. Ploče se ostavljaju na sobnoj temperaturi 45 minuta, nakon čega se rezultati uzimaju u obzir.

Reakcija fiksacije komplementa

Reakcija fiksacije komplementa se sastoji u tome da kada se antigen kombinuje sa antitijelom, nastaje imuni kompleks za koji je komplement vezan preko Fc fragmenta antitijela. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, komplement ostaje slobodan. Slobodni komplement se detektuje dodavanjem hemolitičkog sistema koji se sastoji od ovčijih eritrocita i antitela protiv njih. Pozitivna reakcija je izostanak hemolize kao rezultat vezivanja komplementa za kompleks antigen + antitijelo. Negativna reakcija je prisustvo hemolize kao rezultat vezivanja komplementa za kompleks eritrocit + antieritrocitno antitijelo.

RSK komponente:

Zdrav krvni serum;

Serum krvi pacijenta (razrijeđen 1:5);

Antigenska komponenta reakcije je inaktivirani patogen;

Komplement u razblaženju koje odgovara radnoj dozi. Komplement se dobija iz krvnog seruma zamorca. Titar komplementa je njegova minimalna doza, koja u prisustvu hemolitičkog seruma izaziva potpunu hemolizu eritrocita. Radna doza komplementa koja se koristi u postavljanju CSC je 30% veća od njegovog titra;

Hemolitički sistem - suspenzija eritrocita ovna tretiranih zečjim antitelima na ovnove eritrocite.

Rastvor za pranje.

RSK postavka. RSK je stavljen u dvije epruvete - eksperimentalnu i kontrolnu. U epruvetu se dodaje 0,5 ml krvnog seruma pacijenta, u kontrolnu epruvetu po 0,5 ml seruma zdravog donora, u obe epruvete po 0,5 ml lizata patogena i 0,5 ml komplementa. Nakon svake operacije potrebno je isprati pipetu u rastvoru za pranje. Epruvete se stavljaju u termostat na temperaturu od 37°C na 30 minuta. Nakon inkubacije, u obje epruvete se dodaje po 1,0 ml hemolitičkog sistema. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 30 minuta. Uz pozitivnu reakciju u epruveti, hemoliza se odlaže (bezbojna tekućina i sediment eritrocita), u kontrolnoj epruveti - hemoliza eritrocita.

Literatura za pripremu za lekciju:

1. Borisov mikrobiologija, virologija, imunologija. M., 2002.

2. Medicinska mikrobiologija, virologija i imunologija. Ed. . M., 2004.

3. Pozdeev mikrobiologija. M., GEOTAR-MEDIA, 2005.

Koristi eritrocite ili neutralne sintetičke materijale (na primjer, čestice lateksa), na čijoj površini se adsorbiraju antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni. RBC senzibilizirani antigenima nazivaju se antigenski eritrocitni dijagnostikum i koriste se za otkrivanje i titriranje antitijela. Eritrociti senzibilizirani antitijelima. nazivaju se imunoglobulinski eritrocitni dijagnostici i koriste se za otkrivanje antigena.

Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama (tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoama (malarija) i virusima (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, krpeljne infekcije). encefalitisa, krimske hemoragijske groznice i dr.), kao i za određivanje određenih hormona, za utvrđivanje preosjetljivosti pacijenta na lijekove i hormone, poput penicilina i inzulina.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Test pasivne hemaglutinacije je osjetljiva metoda serološke dijagnostike i koristi se za ranu i retrospektivnu dijagnozu, kao i za određivanje imunološkog stanja vakcinisanih osoba. Kod pacijenata sa tularemijom, antitijela se obično otkrivaju na kraju 1. ili 2. sedmice bolesti, nakon 1-1,5 mjeseci titri TPHA dostižu svoje maksimalne vrijednosti (1:100.000-1:20.000, rjeđe više), nakon čega se oni smanjuju na nivou 1:100-1:200 opstaju dugo vremena.

Kod vakcinisanih se antitela takođe nalaze konstantno, međutim, u nižim titrima, koji ne prelaze 1:2000-1:5000 1-1,5 meseci nakon vakcinacije, ostaju nekoliko godina na niskom nivou od 1:20-1:80.

Tularemia erythrocyte diagnosticum (antigen) služi kao antigen za postavljanje RPHA. Lijek je formalinizirani ovnujski eritrociti senzibilizirani antigenom tularemije, dostupan u tekućem i suhom obliku. Tečni preparat - 10% suspenzija eritrocita u rastvoru formalina 10% koncentracije. Suvi liofilizirani preparat - vakuumski osušena 10% suspenzija eritrocita bez konzervansa. Prije upotrebe razrijedi se prema uputama na etiketi. Za postavljanje reakcije u polistirenskim pločama oba lijeka se koriste u koncentraciji od 2,5%, a kod postavljanja reakcije u mikrovolumenima, u koncentraciji od 0,5%.

RPGA tehnika podešavanja. Test serumi se razblaže fiziološkim rastvorom 1:5 (1:10) i zagrevaju na 56 stepeni C 30 minuta. Nakon toga, kako bi se uklonila heterogena antitijela na ovnove eritrocite, serumi se tretiraju 50% suspenzijom formaliziranih ovnovskih eritrocita. Da bi se to postiglo, eritrociti se dodaju brzinom od 2 kapi (0,05 ml) na 1 ml seruma i dobro promiješaju protresanjem. Serum se ostavlja do potpune sedimentacije eritrocita, ili se centrifugira nakon jednog sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je spreman za istraživanje.

Tečnost za razrjeđivanje se sipa u zapremini od 0,5 ml u više jažica polistirenske ploče. U preliminarnoj studiji seruma, preporučljivo je testirati ih postavljanjem reakcije u kratkom redu ploče (6 rupa). U slučaju detekcije antitela u kratkoj seriji seruma, serumi se ponovo ispituju u dugoj seriji razblaženja (12 jažica). Nakon prolivanja tečnosti za razblaživanje, 0,5 ml test seruma u razblaženju 1:5 dodaje se u prvu jažicu svakog reda (kratku ili dugačku). Zatim se u istim količinama serum titrira dvostrukim razblaženjima. Tako se razrjeđenja seruma dobijaju u kratkoj seriji od 1:10 do 1:320, au dugoj - od 1:10 do 1:20480. Nakon titracije seruma, u svaku jažicu se dodaje jedna kap (0,05 ml) radne 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita. Sadržaj ploča se dobro promućka dok se ne dobije homogena suspenzija. Ploče se ostavljaju na sobnoj temperaturi na stacionarnoj površini stola. Preliminarna registracija reakcije se vrši nakon 2-3 sata, konačno određivanje titra se vrši nakon potpune sedimentacije eritrocita u jamicama. Za reakciju su obezbeđene sledeće kontrole: 1) test serum u razblaženju 1:10 u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibilizovanih eritrocita; 2) tečnost za razblaživanje u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibilizovanih eritrocita; 3) razblaživanje tečnosti u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije senzibilizovanih eritrocita. Sve kontrole treba da daju jasno negativnu reakciju.

Računovodstvo i evaluacija RPGA. Reakcija se procjenjuje prema sljedećoj shemi:

1) oštro pozitivna reakcija (++++) - eritrociti padaju na dno jažice u jednolikom sloju u obliku "kišobrana", u kojem se često uočavaju zaobljeni rubovi;

2) pozitivna reakcija (+++) - eritrociti pokrivaju najmanje 2/3 dna rupe;

3) slabo pozitivna reakcija (++) - aglutinat je mali i nalazi se u samom centru rupe;

4) sumnjiva reakcija (+) - postoje odvojena zrna aglutinata oko sedimenta eritrocita u samom centru rupe;

5) negativan (-) - na dnu rupe, eritrociti se talože u obliku "dugma" ili malog prstena s glatkim, oštro definiranim rubovima.

Titar seruma se uzima u obzir prema posljednjem razrjeđenju seruma, koje je dalo vrlo jasnu reakciju (najmanje tri plusa). Razrjeđenje od 1:100 i više smatra se dijagnostičkim titrom, međutim, kao iu slučaju RA, potrebno je pratiti njegovo povećanje.

TPHA kod tularemije je prilično specifičan i otkriva neke unakrsne reakcije samo sa serumima bruceloze. Diferencijalna dijagnoza je moguća po visini titara u TPHA, koji su mnogo veći kod homolognog antigena.

Tehnika postavljanja RPHA u mikrovolumenima. RPHA se može izvesti u mikrovolumenima koristeći mikrotitar tipa Takachi (ili mikrotitarske ploče sa okruglim dnom sa mikropipetama), što omogućava da se materijal titrira u zapreminama od 25 µl i 50 µl. Tehnika postavljanja reakcija, redoslijed svih operacija je isti kao u studiji u polistirenskim pločama. Međutim, treba imati na umu da je osjetljivost mikrometode obično jedno razrjeđenje (tj. 2 puta) manja od one kod makrometode.

Za postavljanje reakcije u mikrotitru pomoću pipete s kapaljkom, u svaku jažicu se unosi tekućina za razrjeđivanje u volumenu od 50 μl. Zatim se pomoću titratora sa glavom od 50 μl uzima test serum uranjanjem glave u njega. Proverite da li je tečnost ispunila glavu titratora. Titrator sa serumom se prenosi u prvu jažicu i držeći je u vertikalnom položaju, napravi nekoliko rotacijskih pokreta u oba smjera. Zatim se titrator prenosi u sljedeću jažicu i manipulacija se ponavlja. Titracija se može vršiti istovremeno u nekoliko redova. Nakon titracije cijelog reda, titrator se rotacijskim pokretima ispere destilovanom vodom (sa promjenom od 2 porcije), tamponom se uklanja voda iz glave i spaljuje na plamenu gorionika.

Nakon titracije, u jažice se dodaje 25 μl dijagnostikuma eritrocita. Koncentracija dijagnostikuma za RPHA u mikrovolumenima treba da bude 0,5% (tj. 2,5% suspenzija eritrocita se dodatno razblaži 5 puta). Nakon dodavanja eritrocita, ploče treba lagano protresti dok se ne dobije homogena suspenzija. Rezultati se mogu zabilježiti već nakon 1-1,5 sati, što je značajna prednost RPHA u mikrotitru. Osim toga, ova metoda zahtijeva malu količinu svih sastojaka reakcije i test seruma.

Reakcija se objašnjava na sljedeći način:

1) "+" - potpuna hemaglutinacija, u kojoj eritrociti padaju na dno bunara u jednolikom sloju u obliku "kišobrana", koji zauzima najmanje 2/3 dna;

2) "+ -" - djelomična hemaglutinacija, u kojoj eritrociti padaju na dno u obliku labavog prstena male veličine;

3) "-" - odsustvo hemaglutinacije, kada eritrociti padaju na dno u obliku malog dugmeta ili prstena sa glatkim rubom.

Specifičnost pozitivnog rezultata dobijenog u TPHA može se testirati trokomponentnom reakcijom - reakcijom inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA).

RTPGA tehnika podešavanja. Ova reakcija je postavljena da potvrdi specifičnost pozitivnog rezultata RPHA kada je u sumnji ili je od posebnog epidemiološkog interesa. Mehanizam reakcije sastoji se u specifičnoj inhibiciji hemaglutinacije kada se u test serum doda suspenzija ubijenih bakterija tularemije. U reakciji interaguju tri komponente: test serum, specifični antigen tularemije i antigenski eritrocitni dijagnostikum RTPGA obično se postavljaju u red od 7-8 jažica. Preporučljivo je instalirati drugi RPGA paralelno sa RTPGA. U dva reda jažica ulije se po 0,25 ml tečnosti za razblaživanje, zatim se test serum u zapremini od 0,25 ml doda u prve jažice oba reda i titrira. Dobiju se dva identična reda razblaženja seruma. Dodajte 0,25 ml tečnosti za razblaživanje u sve jažice drugog reda, a 0,25 ml suspenzije bakterije tularemije u jažice prvog reda. Koristi se Tularemia diagnosticum (sadrži 25 milijardi bakterija tularemije po 1 ml), prethodno razrijeđen 50 puta. Takva suspenzija sadrži 500 miliona bakterija u 1 ml ili 125 miliona u zapremini od 0,25 ml. Nakon dodavanja antigena, ploča se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda po jedna kap (0,05 ml) dijagnostikuma eritrocita, ploča se protrese i ostavi na ravnoj površini stola. Računovodstvo se vrši za 2-3 sata.

Računovodstvo i evaluacija RTPGA. Ako test serum sadrži specifična antitijela protiv tularemije, ona su neutralizirana dodatkom antigena i hemaglutinacija se neće dogoditi u prvom redu jažica, ili će, s visokim titrom seruma, hemaglutinacija biti uočena u manje (2-4) jažica nego u red sa TPHA. U ovom slučaju potvrđuje se specifičnost rezultata. Ako je hemaglutinacija zabilježena u oba reda, tj. rezultati RTHA i RPHA se poklapaju, što ukazuje na odsustvo antitijela tularemije u test serumu. U ovom slučaju, primarni rezultat RPHA se smatra nespecifičnim.

Tehnika podešavanja RTPGA u mikrovolumenima. RTHA, kao i RPHA, mogu se izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitra tipa Takachi. Da bi se to učinilo, 0,25 μl tečnosti za razblaživanje se dodaje u jažice mikroploča u dva reda od po 7-8 jažica. Zatim se, uz pomoć titratora, 0,25 μl test seruma boduje i titrira u oba reda. Nakon toga se u svaku jažicu u prvom redu dodaje 25 µl antigena tularemije (koncentracija je 500 miliona bakterija tularemije u 1 ml), a u drugom redu 25 µl tečnosti za razblaživanje. Ploče se ostavljaju 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda 25 μl antigenskog dijagnostikuma eritrocita (koncentracija 0,5%). Obračun i evaluacija rezultata se vrši slično kao reakcija u makrovolumenima.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

Reakcija hemaglutinacije

Reakcija aglutinacije

Reakcija aglutinacije (RA) je aglutinacija i precipitacija mikroba ili drugih ćelija pod dejstvom antitela u prisustvu elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). Nastali talog se zove aglutinirati.

Za reakciju vam je potrebno:

1. Antitijela (aglutinini) - nalaze se u serumu pacijenta ili u imunološkom serumu.

2. Antigen - suspenzija živih ili ubijenih mikroorganizama, eritrocita ili drugih ćelija.

3. Izotonični rastvor.

Reakcija aglutinacije za serodijagnostiku se široko koristi za trbušni tifus, paratifus (Vidalova reakcija), brucelozu (Wrightova reakcija), itd. Antitijelo je pacijentov serum, a antigen je poznati mikrob.

Kada se identifikuju mikrobi ili druge ćelije, njihova suspenzija služi kao antigen, a poznati imunološki serum služi kao antitijelo. Ova reakcija se široko koristi u dijagnostici crijevnih infekcija, velikog kašlja itd.

U laboratorijskoj praksi koriste se dvije reakcije hemaglutinacije (RHA) koje se razlikuju po mehanizmu djelovanja.

Prvi RGA odnosi se na serologiju. U ovoj reakciji dolazi do aglutinacije eritrocita u interakciji s odgovarajućim antitijelima (hemaglutininima). Reakcija se široko koristi za određivanje krvnih grupa.

Drugi RGA nije serološki. U njemu, lijepljenje crvenih krvnih stanica nije uzrokovano antitijelima, već posebnim supstancama koje stvaraju virusi. Na primjer, virus gripe aglutinira eritrocite pilića i zamoraca, virus dječje paralize aglutinira eritrocite ovaca. Ova reakcija omogućava procjenu prisutnosti određenog virusa u ispitivanom materijalu.

Ovo je serološka reakcija u kojoj specifična antivirusna antitijela, u interakciji s virusom (antigenom), neutraliziraju ga i lišavaju mu sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica, odnosno inhibiraju reakciju hemaglutinacije. Visoka specifičnost reakcije inhibicije hemaglutinacije (HITA) omogućava njeno korištenje za određivanje tipa, pa čak i tipa virusa otkrivenih tokom HA.

Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RIHA) temelji se na činjenici da eritrociti, ako se na njihovoj površini adsorbira rastvorljivi antigen, stiču sposobnost aglutinacije u interakciji s antitijelima na adsorbirani antigen. RNGA šema je prikazana na sl. RNHA se široko koristi u dijagnostici brojnih infekcija.

Rice. Shema reakcije pasivne hemaglutinacije (RPHA). A - dobijanje eritrocitnog dijagnostikuma; B - RNGA: 1-eritrocit: 2 - proučavani antigen; 3 - dijagnostikum eritrocita; 4 - antitelo na ispitivani antigen: 5 - aglutinat.

Uz pomoć RNHA može se odrediti nepoznati antigen ako su poznata antitijela adsorbirana na eritrocitima.

REAKCIJA INDIREKTNE HEMAGLUTINACIJE, RNGA
(test indirektne hemaglutinacije)

Metoda za detekciju antigena i antitela, zasnovana na sposobnosti eritrocita, na čijoj su površini prethodno adsorbovani antigeni ili antitela, da aglutiniraju u prisustvu homolognih seruma ili odgovarajućih antigena.

Kada se otkriju antigeni, reakcija se pokazuje reverznom pasivnom hemaglutinacijom - ROPHA (reverzni test pasivne hemaglutinacije), a kada se detektuju antitela - pasivnom hemaglutinacijom - RPHA (test pasivne hemaglutinacije). RNHA je našla široku primjenu za detekciju seroloških markera infekcije virusom hepatitisa B, posebno HBsAg i antitijela na njega.

Trenutno su razvijene različite metode za izradu dijagnostikuma eritrocita, koje se razlikuju po metodama senzibilizacije eritrocita (koristeći tanin, glutaraldehid, hrom hlorid, rivanol itd.), njihovim vrstama (ljudski, ovan, piletina, ćuretina itd. .). ), opcije postavljanja reakcije (u mikrotitarskim pločama, u epruvetama, kapilarama itd.) i snimanja rezultata (vizuelno i instrumentalno). Dijagnostikumi eritrocita za detekciju HBsAg i anti-HBs proizvode mnoga preduzeća i firme kako u našoj zemlji, tako iu inostranstvu.

Češće se RNHA provodi u mikrotitarskim pločama, u kojima se prethodno pripremaju razrjeđenja test seruma i kontrolni uzorci. Nakon uvođenja eritrocitnog dijagnostikuma i inkubacije, bilježe se rezultati reakcije. Uzorci u kojima dolazi do aglutinacije eritrocita, koji imaju oblik obrnutog "kišobrana", smatraju se pozitivnim. Uz negativnu reakciju, eritrociti se talože na dno jažice u obliku prstena ili diska.

Da bi se potvrdila specifičnost dobijenih rezultata, reakcija se izvodi i sa "eksperimentalnim" dijagnostikom eritrocita (tj. eritrociti senzibilizirani antigenom ili antitijelima) i sa "kontrolnim" dijagnostikumom (tj. eritrociti nisu senzibilizirani antigenom ili antitijelima) . Prisutnost pozitivne reakcije s "kontrolnim" dijagnostičkim proizvodom ukazuje na lažno pozitivnu reakciju. Da bi se eliminisale nespecifične reakcije, test serum se tretira nesenzibilizovanim eritrocitima. Preduslov za provođenje RNGA je reakcija neutralizacije, odnosno potvrdni test.

U poređenju sa metodama kao što su RPG, VIEF i RSK, reakcija indirektne hemaglutinacije ima veću osetljivost (200-400 puta). Dakle, HBsAg u TPHA se može detektovati u koncentracijama od 6-10 ng/ml. Jednostavnost reakcije i brzina (20 - 30 minuta) odredile su široku upotrebu ove metode u službi transfuzije krvi za detekciju HBsAg.

Pored dijagnostikuma eritrocita, razvijeni su i dijagnostički preparati za detekciju HBsAg i anti-HBs i za detekciju anti-HBc, anti-HBc IgM klase (čvrsta faza), HBeAg, antigena virusa hepatitisa A i antitijela na njega, međutim, svi nisu našli primjenu u praktičnoj zdravstvu.