Monogeenisten ja monitekijäisten sairauksien geeni- ja soluterapia. Ikääntymisen geeniterapia vs farmakologia Geeniterapian kohtaamat haasteet

Duchennen lihasdystrofia on yksi harvoista, mutta silti suhteellisen yleisistä geneettisistä sairauksista. Sairaus diagnosoidaan 3-5-vuotiaana, yleensä pojilla, ilmentyy aluksi vain vaikeina liikkeinä, 10-vuotiaana tällaisesta myodystrofiasta kärsivä ei pysty enää kävelemään, 20-22-vuotiaana hänen elämänsä päättyy. Se johtuu mutaatiosta dystrofiinigeenissä, joka sijaitsee X-kromosomissa. Se koodaa proteiinia, joka yhdistää lihassolukalvon supistuviin kuituihin. Toiminnallisesti tämä on eräänlainen jousi, joka varmistaa solukalvon tasaisen supistumisen ja eheyden. Geenin mutaatiot johtavat luustolihaskudoksen, pallean ja sydämen dystrofiaan. Taudin hoito on luonteeltaan palliatiivista ja voi vain lievittää kärsimystä. Geenitekniikan kehittyessä valoa tunnelin päässä on kuitenkin näkyvissä.

Sodasta ja rauhasta

Geeniterapia on nukleiinihappoihin perustuvien konstruktien kuljettamista soluihin geneettisten sairauksien hoitoon. Tällaisen terapian avulla on mahdollista korjata geneettinen ongelma DNA:n ja RNA:n tasolla muuttamalla halutun proteiinin ilmentymisprosessia. Esimerkiksi DNA:ta, jolla on korjattu sekvenssi, voidaan kuljettaa soluun, josta syntetisoidaan toiminnallinen proteiini. Tai päinvastoin, tiettyjen geneettisten sekvenssien deleetiot ovat mahdollisia, mikä myös auttaa vähentämään mutaation haitallisia vaikutuksia. Teoriassa tämä on yksinkertaista, mutta käytännössä geeniterapia perustuu mikroskooppisten esineiden kanssa työskentelyyn monimutkaisimpiin teknologioihin ja edustaa edistynyttä osaamista molekyylibiologian alalla.

DNA-injektio tsygootin esiytimeen on yksi varhaisimmista ja perinteisistä siirtogeenien luomistekniikoista. Injektio suoritetaan manuaalisesti ultraohuilla neuloilla mikroskoopin alla 400-kertaisella suurennuksella.

"Dystrofiinigeeni, jonka mutaatiot aiheuttavat Duchennen lihasdystrofian, on valtava", sanoo Vadim Zhernovkov, bioteknologiayrityksen Marlin Biotechin kehitysjohtaja, biologisten tieteiden kandidaatti. - Se sisältää 2,5 miljoonaa emäsparia, jota voisi verrata Sota ja rauha -romaanin kirjainten määrään. Ja nyt kuvittele, että olemme repineet pois joitakin tärkeitä sivuja eeposesta. Jos näillä sivuilla kuvataan merkittäviä tapahtumia, kirjan ymmärtäminen olisi jo vaikeaa. Mutta geenin kanssa kaikki on monimutkaisempaa. Sodan ja rauhan toista kopiota ei ole vaikea löytää, ja sitten puuttuvat sivut voisi lukea. Mutta dystrofiinigeeni sijaitsee X-kromosomissa, ja miehillä on vain yksi. Siten vain yksi kopio geenistä on tallennettu poikien sukupuolikromosomeihin syntyessään. Ei ole muuta paikkaa missä sitä viedä.

Lopuksi proteiinisynteesissä RNA:sta on tärkeää säilyttää lukukehys. Lukukehys määrittää, mikä kolmen nukleotidin ryhmä luetaan kodonina, joka vastaa yhtä aminohappoa proteiinissa. Jos DNA-fragmentin geenissä on deleetio, joka ei ole kolmen nukleotidin monikerta, lukukehys siirtyy - koodaus muuttuu. Tätä voisi verrata tilanteeseen, jossa koko jäljellä olevan kirjan revittyjen sivujen jälkeen kaikki kirjaimet korvataan seuraavilla aakkosjärjestyksessä. Hanki abrakadabra. Tämä on sama asia, joka tapahtuu proteiinille, jota ei syntetisoidu oikein."

Biomolekyylinen laastari

Yksi tehokkaista geeniterapian menetelmistä normaalin proteiinisynteesin palauttamiseksi on eksonien ohittaminen lyhyitä nukleotidisekvenssejä käyttämällä. Marlin Biotech on jo kehittänyt teknologian työskentelyyn dystrofiinigeenin kanssa tällä menetelmällä. Kuten tiedetään, transkriptioprosessissa (RNA-synteesi) muodostuu ensin ns. prematriisi-RNA, joka sisältää sekä proteiinia koodaavia alueita (eksoneja) että ei-koodaavia alueita (introneja). Seuraavaksi alkaa silmukointiprosessi, jonka aikana intronit ja eksonit erotetaan ja muodostuu "kypsä" RNA, joka koostuu vain eksoneista. Tällä hetkellä jotkut eksonit voidaan estää, "liimata" erityisten molekyylien avulla. Tämän seurauksena kypsässä RNA:ssa ei ole niitä koodaavia alueita, joista haluaisimme päästä eroon, ja siten lukukehys palautuu, proteiini syntetisoituu.

"Olemme tehneet tämän tekniikan virheenkorjauksen in vitro", sanoo Vadim Zhernovkov eli Duchennen myodystrofiaa sairastavien potilaiden soluista kasvatetuista soluviljelmistä. Mutta yksittäiset solut eivät ole organismi. Solun prosesseihin tunkeutuessa meidän on seurattava seurauksia livenä, mutta ihmisiä ei ole mahdollista saada testeihin eri syistä - eettisistä organisatorisiin. Siksi tuli tarpeelliseksi saada malli Duchennen lihasdystrofiasta tietyillä mutaatioilla, jotka perustuvat koe-eläimeen."

Kuinka pistää mikrokosmos

Siirtogeeniset eläimet ovat laboratoriossa hankittuja eläimiä, joiden genomissa tehdään määrätietoisesti, tietoisesti muutoksia. Jo 1970-luvulla kävi selväksi, että siirtogeenien luominen on tärkein menetelmä geenien ja proteiinien toiminnan tutkimisessa. Yksi varhaisimmista menetelmistä täysin geneettisesti muunnetun organismin saamiseksi oli DNA:n ruiskuttaminen hedelmöitettyjen munien tsygoottien esiytimeen ("ytimen esiaste"). Tämä on loogista, koska eläimen genomia on helpoin muokata sen kehityksen alussa.

Kaavio näyttää CRISPR/Cas9-prosessin, johon kuuluu subgenominen RNA (sgRNA), sen alue, joka toimii ohjaus-RNA:na, ja Cas9-nukleaasiproteiini, joka katkaisee molemmat genomisen DNA:n juosteet ohjaus-RNA:n osoittamasta kohdasta.

Injektio tsygootin ytimeen on hyvin ei-triviaali toimenpide, koska puhumme mikromitoista. Hiiren munan halkaisija on 100 µm ja esituman halkaisija on 20 µm. Leikkaus tapahtuu mikroskoopin alla 400x suurennuksella, mutta injektio on eniten käsityötä. Tietenkään "injektioon" ei käytetä perinteistä ruiskua, vaan erityistä lasineulaa, jonka sisällä on ontto kanava, johon geenimateriaali kerätään. Toista päätä voidaan pitää kädessä, kun taas toinen on erittäin ohut ja terävä - käytännössä näkymätön paljaalla silmällä. Tällaista borosilikaattilasista valmistettua herkkää rakennetta ei tietenkään voida säilyttää pitkään, joten laboratoriossa on käytössään sarja aihioita, jotka piirretään erityisellä koneella juuri ennen työtä. Käytetään erityistä solukontrastikuvausjärjestelmää ilman värjäystä - interventio pronukleukseen on sinänsä traumaattinen ja riskitekijä solujen selviytymiselle. Maali olisi toinen tällainen tekijä. Onneksi munat ovat melko joustavia, mutta siirtogeenisiä eläimiä synnyttävien tsygoottien määrä on vain muutama prosentti DNA:ta injektoitujen munien kokonaismäärästä.

Seuraava vaihe on kirurginen. Parhaillaan on käynnissä leikkaus mikroinjektoitujen tsygoottien siirtämiseksi vastaanottavan hiiren munanjohtimen suppiloon, josta tulee tulevien siirtogeenien korvikeemä. Seuraavaksi koe-eläin käy luonnostaan ​​tiineyssyklin läpi ja jälkeläisiä syntyy. Yleensä pentueessa on noin 20 % siirtogeenisiä hiiriä, mikä viittaa myös menetelmän epätäydellisyyteen, koska se sisältää suuren sattuman elementin. Injektoituna tutkija ei voi valvoa tarkasti, kuinka insertoidut DNA-fragmentit integroituvat tulevan organismin genomiin. On suuri todennäköisyys sellaisille yhdistelmille, jotka johtavat eläimen kuolemaan alkiovaiheessa. Siitä huolimatta menetelmä toimii ja soveltuu varsin useisiin tieteellisiin tarkoituksiin.

Siirtogeenisten teknologioiden kehitys mahdollistaa lääketeollisuuden kysynnän eläinproteiinien valmistamisen. Nämä proteiinit uutetaan siirtogeenisten vuohien ja lehmien maidosta. On myös tekniikoita tiettyjen proteiinien saamiseksi kananmunista.

DNA sakset

Mutta on olemassa tehokkaampi tapa, joka perustuu kohdennettuun genomin muokkaamiseen CRISPR/Cas9-tekniikalla. "Nykyään molekyylibiologia on jossain määrin samanlainen kuin pitkän matkan meriretkien aikakausi purjeiden alla", Vadim Zhernovkov sanoo. — Lähes joka vuosi tässä tieteessä tehdään merkittäviä löytöjä, jotka voivat muuttaa elämäämme. Esimerkiksi useita vuosia sitten mikrobiologit löysivät immuniteetin virusinfektioita vastaan ​​näennäisesti pitkään tutkitusta bakteerilajista. Lisätutkimusten tuloksena kävi ilmi, että bakteeri-DNA sisältää erityisiä lokuksia (CRISPR), joista syntetisoidaan RNA-fragmentteja, jotka voivat sitoutua komplementaarisesti vieraiden elementtien nukleiinihappoihin, esimerkiksi virusten DNA:han tai RNA:han. Cas9-proteiini, joka on nukleaasientsyymi, sitoutuu sellaiseen RNA:han. RNA toimii oppaana Cas9:lle ja merkitsee tietyn DNA-osan, johon nukleaasi tekee leikkauksen. Noin kolmesta viiteen vuotta sitten ilmestyivät ensimmäiset tieteelliset artikkelit, joissa kehitettiin CRISPR/Cas9-teknologiaa genomin muokkausta varten.

Siirtogeeniset hiiret mahdollistavat elävien mallien luomisen ihmisen vakavista geneettisistä sairauksista. Ihmisten pitäisi olla kiitollisia näille pienille olennoille.

Satunnaisliitoskonstruktiomenetelmään verrattuna uusi menetelmä mahdollistaa CRISPR/Cas9-järjestelmän elementtien valitsemisen siten, että RNA-ohjaimet kohdistetaan tarkasti halutuille genomin alueille ja saavutetaan halutun DNA:n kohdennettu deleetio tai insertio. järjestys. Virheet ovat myös mahdollisia tässä menetelmässä (opas RNA joskus kytkeytyy väärään kohtaan, johon se on kohdistettu), mutta CRISPR/Cas9:ää käytettäessä siirtogeenien luomisen tehokkuus on jo noin 80 %. "Tällä menetelmällä on laajat mahdollisuudet paitsi siirtogeenien luomisessa, myös muilla aloilla, erityisesti geeniterapiassa", Vadim Zhernovkov sanoo. "Teknologia on kuitenkin vasta matkansa alussa, ja on melko vaikea kuvitella, että lähitulevaisuudessa ihmiset pystyisivät korjaamaan ihmisten geenikoodia CRISPR/Cas9:n avulla. Niin kauan kuin virheen mahdollisuus on olemassa, on olemassa myös vaara, että henkilö menettää jonkin tärkeän koodaavan osan genomista."

Maito lääke

Venäläinen Marlin Biotech on onnistunut luomaan siirtogeenisen hiiren, jossa Duchennen lihasdystrofiaan johtava mutaatio uusiutuu kokonaan, ja seuraava vaihe on geeniterapiatekniikoiden testaus. Koe-eläimiin perustuvien ihmisten geneettisten sairauksien mallien luominen ei kuitenkaan ole ainoa mahdollinen siirtogeenien sovellus. Niinpä Venäjällä ja länsimaisissa laboratorioissa on meneillään työ biotekniikan alalla, joka mahdollistaa lääketeollisuuden kannalta tärkeiden eläinperäisten lääkeproteiinien saamisen. Lehmät tai vuohet voivat toimia tuottajina, joissa on mahdollista vaihtaa solulaitteistoa maidon sisältämien proteiinien tuotantoon. Maidosta on mahdollista uuttaa lääkeproteiinia, jota ei saada kemiallisella menetelmällä, vaan luonnollisella mekanismilla, mikä lisää lääkkeen tehokkuutta. Tällä hetkellä on kehitetty tekniikoita sellaisten lääkeproteiinien, kuten ihmisen laktoferriinin, prourokinaasin, lysotsyymin, atriinin, antitrombiinin ja muiden, saamiseksi.

Geeniterapia

Baranov V.S. Geeniterapia - XXI-luvun lääketiede // Soros Educational Journal. - 1999. - Nro 3. - S. 63-68. (Pietarin valtionyliopisto)

© Baranov V.S., teksti

© Soros Educational Journal, 1999

© A. Afonin, html-version käsittely ja julkaisu, 2006

<http:// afoniini-59- bio. ihmiset. fi>

<http:// afoniini-59- salix. ihmiset. fi>

JOHDANTO

Molekyylibiologian ja genetiikan ratkaisevat saavutukset eukaryoottisten geenien hienorakenteen tutkimuksessa, niiden kartoittaminen nisäkkäiden ja ennen kaikkea ihmisen kromosomeihin, Human Genome Projectin vaikuttava menestys sellaisten geenien tunnistamisessa ja kloonaamisessa, joiden mutaatiot johtavat lukuisat perinnölliset sairaudet ja lopuksi myrskyinen kasvu biotekniikan ja geenitekniikan alalla olivat välttämättömiä edellytyksiä ensimmäisille yrityksistä hoitaa monogeenisiä sairauksia eläinkokeista ja teoreettisista rakenteista jo vuonna 1989.

Mitä on geeniterapia? Tarkoittaako se hoitoa geenillä lääkkeenä vai vain hoitoa korjaamalla mutatoitunutta geeniä? Nämä ja monet muut kysymykset nousevat väistämättä esille, kun pohditaan sellaista lupaavaa ja mahdollisesti ihmiskunnalle mahdollisesti vaarallista lääketieteen suuntaa tulevalla XXI vuosisadalla geeniterapiana.

LYHYT HISTORIALLINEN YHTEENVETO

Geeniterapia voidaan nykyvaiheessa määritellä perinnöllisten, monitekijäisten ja ei-perinnöllisten (tartuntatautien) hoitoksi viemällä geenejä potilaiden soluihin tarkoituksena muuttaa geenivirheitä tai antaa soluille uusia toimintoja. Ensimmäiset geeniterapiamenetelmien kliiniset kokeet suoritettiin 22. toukokuuta 1989, ja tavoitteena oli kasvaimeen infiltroituneiden lymfosyyttien geneettinen merkitseminen edenneen melanooman tapauksessa. Ensimmäinen monogeeninen perinnöllinen sairaus, johon sovellettiin geeniterapiamenetelmiä, oli adenosiinideaminaasigeenin mutaatiosta johtuva perinnöllinen immuunipuutos. (ILMOITUS). 14. syyskuuta 1990 Bethesdassa (USA) neljävuotiaalle tytölle, joka kärsi tästä melko harvinaisesta sairaudesta (1:100 000), siirrettiin hänen omia lymfosyyttejään, jotka olivat aiemmin muuntuneet kehon ulkopuolelle. (esim vivo) perimä ILMOITUS (geeni ILMOITUS + geeni peo + retrovirusvektori). Terapeuttista vaikutusta havaittiin useita kuukausia, minkä jälkeen toimenpide toistettiin 3...5 kuukauden välein. Kolmen hoitovuoden aikana suoritettiin yhteensä 23 laskimonsisäistä verensiirtoa. ILMOITUS- transformoituneet T-lymfosyytit ilman näkyviä haittavaikutuksia. Hoidon seurauksena potilaan tila parani niin paljon, että hän pystyi elämään normaalia elämää eikä pelännyt vahingossa tapahtuvia infektioita. Toisen tätä sairautta sairastavan potilaan hoito osoittautui yhtä onnistuneeksi. Tällä hetkellä tämän taudin geeniterapian kliinisiä tutkimuksia tehdään Italiassa, Ranskassa, Isossa-Britanniassa ja Japanissa.

Vuonna 1997 kliinisiin tutkimuksiin hyväksyttyjen protokollien määrä oli jo 175, ja niiden toteuttamiseen osallistui yli 2000 potilasta. Suurin osa hankkeista (noin 80 %) koskee syöpäsairauksien sekä HIV-infektion (AIDS) hoitoa. Samalla nykyaikaisessa geeniterapian tutkimuksessa on otettava huomioon, että geenien tai yhdistelmä-DNA:n manipuloinnin seuraukset sisään vivo ei opiskellut tarpeeksi.

Maissa, joissa tämän alan tutkimus on pisimmällä, erityisesti Yhdysvalloissa, sense-DNA-sekvenssejä käyttävät lääketieteelliset protokollat ​​ovat pakollisia asianomaisissa komiteoissa ja lautakunnissa. Yhdysvalloissa nämä ovat Rekombinantti DNA:n neuvoa-antava komitea (RAC) ja Food and Drug Administration (FDA), ja sen jälkeen kansallisten terveysinstituuttien (National Institutes of Health) johtajan on saatava pakollinen hankehyväksyntä. Euroopassa tällaiset protokollat ​​laaditaan ja hyväksytään eurooppalaisen ihmisgeenin siirtoa ja terapiaa käsittelevän työryhmän suositusten mukaisesti.

GENEETISEN SIIRTOMENETELMÄT Geeniterapiassa

Onnistuneen geeniterapian ratkaiseva edellytys on varmistaa vieraan geenin tehokas toimittaminen eli transfektio (laajemmassa merkityksessä) tai transduktio (virusvektoreita käytettäessä) kohdesoluihin, mikä varmistaa sen pitkäaikaisen toiminnan näissä soluissa ja luo edellytykset geenin täydelliselle toiminnalle (sen ilmentymiselle) . Transfektio voidaan suorittaa käyttämällä puhdasta ("alastonta" - paljaa) DNA:ta, joka on dopattu (upotettu) sopivaan plasmidiin, tai kompleksoitua DNA:ta (plasmidi-DNA, joka on yhdistetty suoloihin, proteiineihin (transferriini), orgaanisiin polymeereihin (DEAE-dekstraani, polylysiini, liposomit tai kultahiukkaset) tai DNA:ta viruspartikkelien koostumuksessa, joilta on aiemmin poistettu kyky replikoitua.

Tärkeimmät menetelmät vieraiden geenien kuljettamiseksi soluihin jaetaan kemiallisiin, fysikaalisiin ja biologisiin. Transfektion tehokkuus ja transdusoidun vieraan DNA:n integraatiokyky eri transfektiomenetelmissä kohde-DNA-soluihin eivät ole samat. Vain virusvektorit tai virussekvenssejä sisältävät geneettiset rakenteet kykenevät vieraiden geenien aktiiviseen transduktioon ja joissakin tapauksissa pitkäaikaiseen ilmentymiseen. Yli 175:stä jo hyväksytystä geeniterapian kliinisestä tutkimusprotokollasta yli 120 sisältää virustransduktion, ja noin 100 niistä perustuu retrovirusvektoreihin.

Tietojen tarkastelu johtaa siihen johtopäätökseen, että monien maailman laboratorioiden ponnisteluista huolimatta kaikki jo tunnetut ja testatut sisään vivo ja sisään vitro vektorijärjestelmät ovat kaukana täydellisistä. Jos ongelma on vieraan DNA:n toimittamisessa sisään vitro käytännössä ratkaistu, ja sen toimittaminen eri kudosten kohdesoluihin sisään vivo onnistuneesti ratkaistu (lähinnä luomalla rakenteita, jotka kantavat reseptoriproteiineja, mukaan lukien tietyille kudoksille spesifisiä antigeenejä), sitten olemassa olevien vektorijärjestelmien muut ominaisuudet - integraation stabiilius, säädelty ilmentyminen, turvallisuus - vaativat edelleen vakavia parannuksia.

Ensinnäkin se koskee integraation vakautta. Toistaiseksi integraatio genomiin on saavutettu vain käyttämällä retrovirus- tai adeno-assosioituneita vektoreita. Stabiilin integraation tehokkuutta voidaan lisätä parantamalla geenirakenteita, kuten reseptorivälitteisiä järjestelmiä, tai luomalla riittävän stabiileja episomaalisia vektoreita (eli DNA-rakenteita, jotka kykenevät pysymään pitkällä aikavälillä ytimien sisällä).

Reseptorivälitteinen geeninsiirto on seuraava. Halutun geenin DNA-sekvenssi on liitetty tiettyyn aineeseen (esim. glykoproteiiniin), jolla on korkea affiniteetti transformoidun solun spesifiseen membraanireseptoriin (esim. hepatosyyttiin). Tuloksena oleva kompleksi yhdistetään adenovirukseen, mikä varmistaa geenirakenteen tunkeutumisen solun tumaan. Tällainen yhdistetty vektori tarjoaa geenin tehokkaan kohdistetun toimituksen spesifisiin soluihin.

Viime aikoina on kiinnitetty erityistä huomiota nisäkkäiden keinotekoisiin kromosomeihin (Mammalian Artificial Chromosomes) perustuvien vektoreiden luomiseen. Tavallisten kromosomien perusrakenneosien läsnäolon ansiosta tällaiset minikromosomit säilyvät soluissa pitkään ja pystyvät kuljettamaan täysikokoisia (genomisia) geenejä ja niiden luonnollisia säätelyelementtejä, jotka ovat välttämättömiä oikealle toiminnalle. geenistä, oikeassa kudoksessa ja oikeaan aikaan.

Geeniterapian PERIAATTEET

Riippuen menetelmästä, jolla eksogeeninen DNA viedään potilaan genomiin, geeniterapia voidaan suorittaa joko soluviljelmässä (ex vivo), tai suoraan kehoon (sisään vivo). Solugeeniterapia tai -terapia ex vivo sisältää potilaan tiettyjen solutyyppien eristämisen ja viljelyn sisään vitro, vieraiden geenien vieminen niihin (esimerkiksi kehon immuunivasteen vahvistaminen), transfektoitujen solukloonien valinta ja niiden uudelleeninfuusio (tuottaminen) samalle potilaalle. Tätä lähestymistapaa käytetään tällä hetkellä useimmissa kliinisiin kokeisiin hyväksytyissä geeniterapiaohjelmissa.

Geeniterapia sisään vivo perustuu kloonattujen ja spesifisesti pakattujen DNA-sekvenssien suoraan viemiseen potilaan tiettyihin kudoksiin. Erityisen lupaava geenisairauksien hoitoon in vivo geenien lisääminen aerosoli- tai ruiskerokotteiden avulla esitetään. Aerosoligeeniterapiaa kehitetään pääsääntöisesti keuhkosairauksien (kystinen fibroosi, keuhkosyöpä) hoitoon.

Geeniterapiaohjelman kehittämistä edeltää vastaavan geenin kudosspesifisen ilmentymisen perusteellinen analyysi, primaarisen biokemiallisen vian tunnistaminen, sen proteiinituotteen rakenteen, toiminnan ja solunsisäisen jakautumisen tutkimus sekä geenin biokemiallinen analyysi. patologinen prosessi. Kaikki nämä tiedot otetaan huomioon laadittaessa asianmukaista lääketieteellistä protokollaa. Perinnöllisen sairauden geenikorjausmenettelyn hyväksyntä suoritetaan potilaan primäärisoluviljelmillä, joissa tämä geeni on normaalisti toiminnallisesti aktiivinen. Näitä solumalleja käyttäen arvioidaan valitun eksogeenisen DNA:n siirtojärjestelmän tehokkuus, määritetään tuodun geneettisen konstruktin ilmentyminen, analysoidaan sen vuorovaikutus solugenomin kanssa ja kehitetään korjausmenetelmiä biokemiallisella tasolla.

Soluviljelmien avulla on mahdollista kehittää järjestelmä rekombinantti-DNA:n kohdennetulle kuljetukselle, mutta tämän järjestelmän luotettavuutta voidaan testata vain koko organismin tasolla. Siksi geeniterapiaohjelmissa tällainen huomio kiinnitetään kokeisiin. sisään vivo vastaavien eläinten perinnöllisten sairauksien luonnollisissa tai keinotekoisesti saaduissa malleissa. Tällaisten eläinten geneettisten vikojen onnistunut korjaaminen ja geeniterapian ei-toivottujen sivuvaikutusten puuttuminen ovat tärkeimmät edellytykset kliinisten kokeiden hyväksymiselle.

Siten perinnöllisen vian geenikorjauksen standardijärjestelmä sisältää sarjan peräkkäisiä vaiheita. Se alkaa täysin toimivan (ilmentyvän) geneettisen rakenteen luomisella, joka sisältää geenin sense- (proteiinikoodaus) ja säätelyosat. Seuraavassa vaiheessa ratkaistaan ​​ongelma vektorista, joka tarjoaa tehokkaan ja, mikäli mahdollista, kohdistetun geenin kuljetuksen kohdesoluihin. Sitten suoritetaan transfektio (saadun konstruktin siirto) kohdesoluihin, transfektion tehokkuus, primaarisen biokemiallisen vian korjattavuuden aste soluviljelyolosuhteissa arvioidaan. (sisään vitro) ja kaikkein tärkeimpänä, sisään vivo eläinbiologisissa malleissa. Vasta sitten kliininen tutkimusohjelma voi alkaa.

MONOGEENISTEN PERINNÖLLISTEN SAIREJEN GENERAPIA

Ensimmäisten kliinisten tutkimusten menestys oli voimakas sysäys nopeuttaa uusien geeniterapiamenetelmien kehitystä suhteessa muihin perinnöllisiin sairauksiin. Alla on luettelo sairauksista, joihin geeniterapia on pohjimmiltaan mahdollista, joihin geenikorjaus todennäköisesti tehdään lähitulevaisuudessa, sekä niistä sairauksista, joihin on jo virallisesti hyväksytty protokollia ja jotka ovat eri vaiheissa kliinisistä tutkimuksista.

pöytä 1– Perinnölliset sairaudet, joiden genokorrektio on kliinisten tutkimusten (CT), kokeellisen kehityksen (ER) vaiheessa ja on pohjimmiltaan mahdollista (PV)

GENOTERAPIA EI-PERINNÖLLEISIIN TAUTEISIIN

Samanaikaisesti perinnöllisten vaurioiden geenikorjauksen alan tutkimuksen kehittymisen kanssa on menestynyt myös sense-DNA-sekvenssien terapeuttisen käytön menetelmien etsiminen ei-perinnöllisten sairauksien ja pääasiassa pahanlaatuisten kasvainten ja virusinfektioiden hoitoon. Merkittävää on, että juuri näillä patologian alueilla etsitään geenikorjausmenetelmiä erityisen intensiivisesti ja jo hyväksyttyjen kliinisten tutkimusten määrä on monta kertaa suurempi kuin monogeenisten sairauksien hoitoon tarkoitettujen.

Alla on lueteltu tärkeimmät metodologiset lähestymistavat erilaisten kasvainten geeniterapiaan, jotka on kehitetty ja joita käytetään jo laajalti. Monet näistä lähestymistavoista soveltuvat myös vakavimpiin tartuntatauteihin, kuten HIV-infektioon (AIDS).

Näiden lähestymistapojen ensimmäisten kliinisten tutkimusten tulokset ovat olleet erittäin rohkaisevia erityisesti hermoston hermostoa rappeuttavien ja onkologisten sairauksien hoidossa.

Taulukko 2 - Tärkeimmät lähestymistavat onkologisten sairauksien geenikorjauksessa

JOITAKIN EETTISET JA SOSIAALISET KYSYMYKSET

GEENITERAPIA

Pohjimmiltaan uusien teknologioiden syntymisestä, jotka mahdollistavat geenejä ja niiden fragmentteja aktiivisesti manipuloida ja varmistaa uusien geneettisen informaation kohdennetun toimituksen tietyille genomin alueille, on tullut tärkeä tapahtuma biologiassa ja lääketieteessä.

Jo nyt, nykyisellä tiedon tasolla ihmisen genomista, tällaiset modifikaatiot ovat teoriassa täysin mahdollisia joidenkin fyysisten (esimerkiksi korkeuden), henkisten ja älyllisten parametrien parantamiseksi. Siten nykyaikainen ihmistiede on uudessa kehitysvaiheessaan palannut ajatukseen ihmisrodun parantamisesta, jonka aikoinaan olettaa erinomainen englantilainen geneetikko F. Galton ja jonka hänen opiskelijansa ja seuraajansa Iso-Britanniassa ovat kehittäneet (K. Pearson). , L. Penrose, J. Haldane), Venäjällä (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), Yhdysvalloissa (G. Möller). Historian myöhempi kulku, kuten tiedetään, hylkäsi täysin ajatuksen ihmiskunnan parantamisesta. Ihmisen tuleva kaikkivaltius omaan genomiinsa pakottaa meidät kuitenkin palaamaan tähän aiheeseen yhä uudelleen ja uudelleen, jolloin siitä käydään jatkuvaa vilkasta keskustelua laajassa ja tieteellisessä lehdistössä. Ei ole epäilystäkään siitä, että ihmisen geenitekniikkaan liittyvät alkuperäiset pelot olivat perusteettomia. Geeniterapian käyttö monien sairauksien hoidossa on jo tunnustettu. Ainoa ja välttämätön rajoitus, joka on voimassa myös nykyaikaisissa olosuhteissa, on se, että kaikki geeniterapiatoimenpiteet tulee suunnata vain tietylle potilaalle ja koskea yksinomaan hänen somaattisia solujaan.

Nykyinen tietotaso ei mahdollista geenivirheiden korjaamista sukusolujen ja varhaisten istutusta edeltävien ihmisalkioiden solujen tasolla, koska on todellinen vaara, että geenipooli tukkeutuu ei-toivotuilla keinotekoisilla geenirakenteilla tai aiheuttaa mutaatioita, joilla on arvaamattomia seurauksia. ihmiskunnan tulevaisuuden puolesta. Samaan aikaan tieteellisessä kirjallisuudessa kuullaan yhä enemmän ja sitkeämmin kehotuksia käynnistää uudelleen keskustelu ihmisen sukusolujen ja sukusolujen geenikorjauksen tarkoituksenmukaisuudesta.

Nämä ovat joitakin kysymyksiä, joita tulisi käsitellä geneetikkojen ehdottamassa laajemmassa keskustelussa geeniterapiasta.

1. Pystyykö geeniterapia tulevaisuudessa tarjoamaan niin täydellisen geenikorjauksen, joka ei aiheuta uhkaa jälkeläisille?

2. Missä määrin geeniterapian hyödyllisyys ja välttämättömyys yhdelle avioparille on suurempi kuin tällaisen toimenpiteen riski koko ihmiskunnalle?

3. Kuinka perusteltuja nämä menettelyt ovat planeetan tulevan ylikansoituksen taustalla?

4. Miten ihmisiin kohdistuvat geenitekniikan toimenpiteet korreloivat yhteiskunnan ja biosfäärin homeostaasiongelmien kanssa?

Siten geneettinen vallankumous, jonka apoteoosina oli geeniterapia, ei ainoastaan ​​tarjoa todellisia tapoja hoitaa vaikeita perinnöllisiä ja ei-perinnöllisiä sairauksia, vaan myös nopeassa kehityksessään asettaa yhteiskunnalle uusia ongelmia, joiden ratkaisua tarvitaan kipeästi. lähitulevaisuudessa.

Geeniterapia on yksi nopeasti kehittyvistä lääketieteen aloista, jossa ihmistä hoidetaan tuomalla terveitä geenejä kehoon. Lisäksi tutkijoiden mukaan geeniterapian avulla voit lisätä puuttuvan geenin, korjata tai korvata sen, mikä parantaa kehon toimintaa solutasolla ja normalisoi potilaan tilan.

Tiedemiesten mukaan 200 miljoonaa planeetan asukasta on potentiaalisia ehdokkaita geeniterapiaan tänään, ja tämä luku kasvaa jatkuvasti. Ja on erittäin ilahduttavaa, että useat tuhannet potilaat ovat jo saaneet hoitoa parantumattomiin vaivoihin osana meneillään olevia tutkimuksia.

Tässä artikkelissa puhumme siitä, mitä tehtäviä geeniterapia asettaa itselleen, mitä sairauksia voidaan hoitaa tällä menetelmällä ja mitä ongelmia tiedemiesten on kohdattava.

Missä geeniterapiaa käytetään?

Alun perin geeniterapia suunniteltiin vaikeiden perinnöllisten sairauksien, kuten Huntingtonin taudin, kystisen fibroosin (kystisen fibroosin) ja joidenkin tartuntatautien torjumiseksi. Kuitenkin vuodesta 1990, jolloin tutkijat onnistuivat korjaamaan viallisen geenin ja viemällä sen potilaan kehoon kukistamaan kystisen fibroosin, tuli todella vallankumouksellinen geeniterapian alalla. Miljoonat ihmiset ympäri maailmaa ovat saaneet toivoa sellaisten sairauksien hoidosta, joita aiemmin pidettiin parantumattomina. Ja vaikka tällainen terapia on aivan kehityksen alussa, sen potentiaali on yllättävää jopa tieteellisessä maailmassa.

Joten esimerkiksi kystisen fibroosin lisäksi nykyaikaiset tiedemiehet ovat saavuttaneet menestystä torjuttaessa sellaisia ​​perinnöllisiä patologioita, kuten hemofilia, entsymopatia ja immuunipuutos. Lisäksi geeniterapian avulla voit torjua joitain syöpiä, samoin kuin sydänsairauksia, hermoston sairauksia ja jopa vammoja, esimerkiksi hermovaurioita. Geeniterapiassa käsitellään siis äärimmäisen vaikeakulkuisia sairauksia, jotka johtavat varhaiseen kuolemaan ja joihin ei useinkaan ole muuta hoitoa kuin geeniterapia.

Geeniterapian periaate

Lääkärit käyttävät vaikuttavana aineena geneettistä tietoa, tai tarkemmin sanottuna molekyylejä, jotka kantavat sellaista tietoa. Harvemmin tähän käytetään RNA-nukleiinihappoja ja useammin DNA-soluja.

Jokaisessa tällaisessa solussa on niin kutsuttu "xerox" - mekanismi, jolla se muuntaa geneettisen tiedon proteiineiksi. Solu, jossa on oikea geeni ja kserox toimii ongelmitta, on geeniterapian näkökulmasta terve solu. Jokaisessa terveessä solussa on kokonainen kirjasto alkuperäisiä geenejä, joita se käyttää koko organismin oikeaan ja koordinoituun työhön. Jos kuitenkin jostain syystä jokin tärkeä geeni katoaa, sitä ei ole mahdollista palauttaa.

Tämä aiheuttaa vakavien geneettisten sairauksien, kuten Duchennen myodystrofian, kehittymisen (sen myötä potilas etenee lihashalvaukseen, ja useimmissa tapauksissa hän ei elä 30-vuotiaaksi, kuolee hengityspysähdyksissä). Tai vähemmän tappava. Esimerkiksi tietyn geenin "rikkoutuminen" johtaa siihen, että proteiini lakkaa suorittamasta tehtäviään. Ja tämä aiheuttaa hemofilian kehittymisen.

Kaikissa näissä tapauksissa tulee apuun geeniterapia, jonka tehtävänä on toimittaa normaali kopio geenistä sairaaseen soluun ja laittaa se solun ”kopiokoneeseen”. Tässä tapauksessa solun työ paranee ja ehkä koko organismin toiminta palautuu, minkä ansiosta ihminen pääsee eroon vakavasta sairaudesta ja voi pidentää elämäänsä.

Mitä sairauksia geeniterapia hoitaa?

Miten geeniterapia todella auttaa ihmistä? Tutkijoiden mukaan maailmassa on noin 4 200 sairautta, jotka johtuvat geenien toimintahäiriöistä. Tässä suhteessa tämän lääketieteen alueen potentiaali on yksinkertaisesti uskomaton. Paljon tärkeämpää on kuitenkin se, mitä lääkärit ovat onnistuneet saavuttamaan tänään. Tietenkin vaikeuksia matkan varrella riittää, mutta vielä tänäänkin voimme nostaa esiin useita paikallisia voittoja.

Esimerkiksi nykyajan tutkijat kehittävät lähestymistapoja sepelvaltimotaudin hoitoon geenien avulla. Mutta tämä on uskomattoman yleinen sairaus, joka vaikuttaa useampaan ihmiseen kuin synnynnäiset sairaudet. Lopulta sepelvaltimotautia kohtaava ihminen joutuu tilaan, jossa geeniterapia voi olla hänelle ainoa pelastus.

Lisäksi nykyään geenien avulla hoidetaan keskushermoston vaurioihin liittyviä patologioita. Nämä ovat sairauksia, kuten amyotrofinen lateraaliskleroosi, Alzheimerin tauti tai Parkinsonin tauti. Mielenkiintoista on, että näiden sairauksien hoitoon käytetään viruksia, jotka yleensä hyökkäävät hermostoon. Joten herpesviruksen avulla hermostoon toimitetaan sytokiineja ja kasvutekijöitä, jotka hidastavat taudin kehittymistä. Tämä on elävä esimerkki siitä, kuinka tavallisesti sairauksia aiheuttava patogeeninen virus käsitellään laboratoriossa, siitä poistetaan tautia kantavat proteiinit ja käytetään kasettina, joka kuljettaa parantavia aineita hermoihin ja toimii siten terveyden hyväksi, pidentää ihmisen toimintaa. elämää.

Toinen vakava perinnöllinen sairaus on kolesterolikemia, joka johtaa kehon kyvyttömyyteen säädellä kolesterolia, minkä seurauksena rasvat kerääntyvät elimistöön ja sydänkohtausten ja aivohalvausten riski kasvaa. Tämän ongelman ratkaisemiseksi asiantuntijat poistavat osan maksasta potilaasta ja korjaavat vaurioituneen geenin, mikä estää kolesterolin kertymisen kehoon. Tämän jälkeen korjattu geeni sijoitetaan neutraloituun hepatiittivirukseen, jonka avulla se lähetetään takaisin maksaan.

Lue myös:

Myös AIDS:n torjunnassa on tapahtunut myönteistä kehitystä. Ei ole mikään salaisuus, että AIDSin aiheuttaa ihmisen immuunikatovirus, joka tuhoaa immuunijärjestelmän ja avaa portin kehoon tappaville sairauksille. Nykyajan tiedemiehet osaavat jo muuttaa geenejä niin, että ne lopettavat immuunijärjestelmän heikentämisen ja alkavat vahvistaa sitä torjuakseen virusta. Tällaisia ​​geenejä viedään veren kautta, sen verensiirron kautta.

Geeniterapia toimii myös syöpää, erityisesti ihosyöpää (melanoomaa) vastaan. Tällaisten potilaiden hoitoon kuuluu tuumorinekroositekijöitä sisältävien geenien, so. geenit, jotka sisältävät kasvaimia estävää proteiinia. Lisäksi nykyään tehdään aivosyövän hoitokokeita, joissa sairaille potilaille ruiskutetaan geeniä, joka sisältää tietoa, joka lisää pahanlaatuisten solujen herkkyyttä käytettäville lääkkeille.

Gaucherin tauti on vakava perinnöllinen sairaus, joka johtuu geenin mutaatiosta, joka estää erityisen entsyymin - glukoserebrosidaasin - tuotantoa. Tästä parantumattomasta taudista kärsivien henkilöiden perna ja maksa ovat suurentuneet, ja taudin edetessä luut alkavat hajota. Tiedemiehet ovat jo onnistuneet kokeissa, joilla tällaisten potilaiden kehoon viedään geeni, joka sisältää tietoa tämän entsyymin tuotannosta.

Ja tässä on toinen esimerkki. Ei ole mikään salaisuus, että sokea menettää kykynsä havaita visuaalisia kuvia loppuelämänsä ajaksi. Yksi synnynnäisen sokeuden syistä on niin sanottu Leberin atrofia, joka itse asiassa on geenimutaatio. Tähän mennessä tutkijat ovat palauttaneet näkökyvyt 80 sokealle käyttämällä modifioitua adenovirusta, joka toimitti "toimivan" geenin silmäkudokseen. Muuten, muutama vuosi sitten tutkijat onnistuivat parantamaan kokeellisten apinoiden värisokeuden viemällä terveen ihmisen geenin eläimen silmän verkkokalvoon. Ja viime aikoina tällainen leikkaus mahdollisti värisokeuden parantamisen ensimmäisillä potilailla.

Ilmeisesti geenitietojen välitystapa virusten avulla on optimaalinen, koska virukset itse löytävät kohteensa kehosta (herpesvirus löytää varmasti hermosolut ja hepatiittivirus maksan). Tällä geeninsiirtomenetelmällä on kuitenkin merkittävä haittapuoli - virukset ovat immunogeenejä, mikä tarkoittaa, että jos ne joutuvat elimistöön, immuunijärjestelmä voi tuhota ne ennen kuin ne ehtivät toimia, tai jopa aiheuttaa kehon voimakkaita immuunivasteita. huonontaa terveydentilaa.

On toinenkin tapa toimittaa geenimateriaalia. Se on pyöreä DNA-molekyyli tai plasmidi. Se kiertyy täydellisesti ja tulee erittäin kompaktiksi, minkä ansiosta tutkijat voivat "pakkaa" sen kemialliseen polymeeriin ja viedä sen soluun. Toisin kuin virus, plasmidi ei aiheuta immuunivastetta kehossa. Tämä menetelmä on kuitenkin vähemmän sopiva, koska 14 päivää myöhemmin plasmidi poistetaan solusta ja proteiinin tuotanto pysähtyy. Toisin sanoen tällä tavalla geeniä täytyy viedä sisään pitkään, kunnes solu "palautuu".

Siten nykyaikaisilla tiedemiehillä on kaksi tehokasta menetelmää geenien toimittamiseksi "sairaille" soluille, ja virusten käyttö näyttää olevan edullisempaa. Joka tapauksessa lopullisen päätöksen tietyn menetelmän valinnasta tekee lääkäri potilaan kehon reaktion perusteella.

Geeniterapian kohtaamat ongelmat

Voidaan päätellä, että geeniterapia on vähän tutkittu lääketieteen ala, johon liittyy suuri määrä epäonnistumisia ja sivuvaikutuksia, ja tämä on sen valtava haittapuoli. On kuitenkin olemassa myös eettinen ongelma, koska monet tutkijat vastustavat kategorisesti puuttumista ihmiskehon geneettiseen rakenteeseen. Siksi sukusolujen käyttö geeniterapiassa on nykyään kansainvälinen kielto, kuten myös istutusta edeltävien sukusolujen käyttö. Tämä tehdään ei-toivottujen geenimuutosten ja mutaatioiden estämiseksi jälkeläisissämme.

Muuten geeniterapia ei riko mitään eettisiä normeja, koska se on suunniteltu taistelemaan vakavia ja parantumattomia sairauksia vastaan, joissa virallinen lääketiede on yksinkertaisesti voimaton. Ja tämä on geeniterapian tärkein etu.
Pitä huolta itsestäsi!

14943 0

Sen geenin lokalisoinnin ja sekvenssin selvittäminen, jonka mutaatiot aiheuttavat tiettyjä sairauksia, sekä itse mutaatio ja nykyaikaiset testausmenetelmät mahdollistavat taudin diagnosoinnin organismin neo- ja jopa prenataalisessa kehitysvaiheessa. Tämä mahdollistaa geneettisen vian ilmenemisen lieventämisen lääkehoidon, ruokavalion, verensiirron jne. avulla.

Tämä lähestymistapa ei kuitenkaan johda itse vian korjaamiseen, ja yleensä perinnöllisiä sairauksia ei voida parantaa. Tilannetta vaikeuttaa entisestään se, että yhden geenin mutaatiolla voi olla erilaisia ​​seurauksia kehossa. Jos geenimutaatio aiheuttaa muutoksia sen koodaaman entsyymin aktiivisuudessa, se voi johtaa myrkyllisen substraatin kerääntymiseen tai päinvastoin solun normaalille toiminnalle välttämättömän yhdisteen puutteeseen.

Tunnettu esimerkki tällaisesta sairaudesta on fenyyliketonuria. Se johtuu mutaatiosta maksaentsyyminenissä, joka katalysoi fenyylialaniinin muuttumista tyrosiiniksi. Tämän seurauksena endogeenisen fenyylialaniinin taso veressä nousee, mikä aiheuttaa epäasianmukaisen myeliinivaipan muodostumisen keskushermoston hermosolujen aksonien ympärille ja tämän seurauksena vakavan henkisen jälkeenjääneisyyden.

Jos mutaatio vaikuttaa rakenneproteiinigeeniin, se voi johtaa vakaviin häiriöihin solujen, kudosten tai elinten tasolla. Esimerkki tällaisesta sairaudesta on kystinen fibroosi.

Kystisen fibroosin kuljettajaksi kutsuttua proteiinia koodaavan geenin deleetio johtaa viallisen proteiinin synteesiin (fenyylialaniini 508:n puuttuminen) ja kloridi-ionien kuljetuksen heikkenemiseen solukalvojen läpi. Yksi tämän haitallisimmista vaikutuksista on, että keuhkoja vuoraava ja suojaava lima muuttuu epätavallisen paksuksi. Tämä vaikeuttaa pääsyä keuhkojen soluihin ja edistää haitallisten mikro-organismien kerääntymistä. Keuhkojen hengitysteitä peittävät solut kuolevat ja korvautuvat kuituisella arpikudoksella (tästä taudin nimi). Tämän seurauksena potilas kuolee hengitysvajaukseen.

Perinnöllisille sairauksille on ominaista monimutkaiset kliiniset ilmenemismuodot, ja niiden perinteinen hoito on pääosin oireenmukaista: fenyyliketonurian hoitoon määrätään alaniiniton ruokavalio, vialliset proteiinit korvataan toiminnallisella suonensisäisellä annolla ja kompensoimiseksi siirretään luuydintä tai muita elimiä. kadonneiden toimintojen vuoksi. Kaikki nämä toimenpiteet ovat pääsääntöisesti tehottomia, kalliita, pitkäaikaisia, ja vain harvat potilaat elävät vanhuuteen. Siksi pohjimmiltaan uudenlaisten hoitomuotojen kehittäminen on erittäin tärkeää.

Geeniterapia

Vuonna 1990 Yhdysvalloissa tohtori W. French Andrson teki ensimmäisen geeniterapiayrityksen vaikean yhdistetyn immuunivajavuuden (SCID) hoitoon kolmivuotiaalla tytöllä, Ashanti de Silvalla. Tämä sairaus johtuu adenosanadenylaasia (ADA) koodaavan geenin mutaatiosta. Tämän entsyymin puute edistää adenosiinin ja deoksiadenosiinin kertymistä vereen, minkä myrkyllinen vaikutus johtaa B- ja T-lymfosyyttien kuolemaan ääreisveressä ja sen seurauksena immuunipuutokseen.

Lapset, joilla on tällainen sairaus, on suojattava kaikilta infektioilta (säilytettävä erityisissä steriileissä soluissa), koska mikä tahansa sairaus voi olla kohtalokas. Neljä vuotta hoidon aloittamisen jälkeen lapsella ilmeni normaalisti toimiva ADA ja SCID-oireet helpottivat, minkä ansiosta hän pääsi poistumaan steriilistä kammiosta ja elää normaalia elämää.

Siten somaattisten solujen onnistuneen geneettisen terapian perustavanlaatuinen mahdollisuus osoitettiin. 90-luvulta lähtien. geeniterapiaa testataan useiden geneettisten sairauksien varalta, mukaan lukien sellaiset vakavat sairaudet kuin hemofilia, AIDS, erilaiset pahanlaatuiset kasvaimet, kystinen fibroosi jne. Tällä hetkellä noin 10 ihmisen sairautta voidaan parantaa transgeneesin avulla.

Geneettisten sairauksien monimuotoisuus on edeltänyt useiden geeniterapian lähestymistapojen kehittämistä. Tässä tapauksessa ratkaistaan ​​2 pääongelmaa: keino terapeuttisen geenin kuljettamiseksi; menetelmä kohdennetun toimituksen aikaansaamiseksi korjaukseen tarkoitettuihin soluihin. Tähän mennessä kaikki somaattisten solujen geeniterapian lähestymistavat voidaan jakaa kahteen kategoriaan: ex vivo ja in vivo -terapiaan (kuva 3.15).

Riisi. 3.15. Geeniterapiakaavio ex vivo (a) ja in vivo (a)

In vivo -geeniterapiaan kuuluu terapeuttisen geenin toimittaminen suoraan tietyn potilaan kudoksen soluihin. Tarkastellaanpa näitä lähestymistapoja yksityiskohtaisemmin.

Ex vivo -geeniterapia sisältää seuraavat vaiheet:
1) potilaan viallisten solujen hankkiminen ja niiden viljely;
2) halutun geenin siirtäminen eristettyihin soluihin transfektoimalla terapeuttinen geenirakenne;
3) geneettisesti korjattujen solujen valinta ja kasvu;
4) näiden solujen siirto tai siirto potilaaseen.

Potilaan omien solujen käytöllä varmistetaan, että kun ne on palautettu, potilaalle ei synny immuunivastetta. Geenikonstruktioiden siirtomenettelyn on oltava tehokas ja normaali geeni on säilytettävä stabiilisti ja ilmennettävä jatkuvasti.

Luonnon itsensä luomien geenien siirtokeinoja ovat virukset. Tehokkaiden vektoreiden saamiseksi geenin kuljettamiseen käytetään pääasiassa kahta virusryhmää - adenoviruksia ja retroviruksia (kuva 3.16). Geeniterapiassa käytetään geneettisesti neutraloitujen virusten variantteja.

Riisi. 3.16. Viruksia käytetään terapeuttisten vektoreiden luomiseen

Riisi. 3.17. Tyypillisen retroviruksen geneettinen kartta (a) ja retrovirusvektorikartta (a)

Retrovirusvektorin vastaanotettuaan retroviruksen täyspitkä DNA insertoidaan plasmidiin, suurin osa gag-geenistä poistetaan ja pol- ja env-geenit poistetaan kokonaan, ja niiden sijaan "terapeuttinen" T-geeni ja Tarvittaessa markkeriselektiivinen Rg-geeni, jossa on oma promoottori, insertoidaan (kuvio 3.17, b). T-geenin transkriptiota säätelee sama vahva promoottori, joka sijaitsee 5'-LTR-alueella.Tämän kaavion perusteella luotiin erilaisia ​​retrovirusvektoreita ja DNA-insertin maksimikoko noin 8 kb.

Näin saatua konstruktia voidaan käyttää sellaisenaan transformaatioon, mutta sen tehokkuus ja myöhempi integraatio isäntäsolun genomiin on erittäin alhainen. Siksi kehitettiin menetelmä retrovirusvektorin täyspitkän RNA:n pakkaamiseksi ehjiin viruspartikkeleihin, jotka tunkeutuvat soluun suurella taajuudella ja jotka taatusti integroituvat isäntägenomiin. Tätä varten luotiin niin kutsuttu "pakkaus"-solulinja. Näiden solujen kromosomien kahteen eri osaan on ommeltu retrovirusgeenit gag ja pol-env, joilta puuttuu + (84*+) -sekvenssin puuttuminen (kuva 3.18).

Riisi. 3.18. Kaavio pakatun virusvektorin saamiseksi

Retrovirukset infektoivat aktiivisesti vain nopeasti jakautuvia soluja. Geeninsiirtoa varten niitä käsitellään puhdistetuilla pakatuilla retrovirusvektoripartikkeleilla tai viljellään yhdessä niitä tuottavan solulinjan kanssa ja valitaan sitten kohde- ja pakkaussolujen erottamiseksi.

Transdusoidut solut tarkistetaan huolellisesti terapeuttisen geenituotteen synteesin tason, replikaatiokykyisten retrovirusten puuttumisen ja solujen kasvu- tai toimintakyvyn muutosten puuttumisen suhteen.

Geeniterapiaan sopivimpia ovat luuydinsolut. Tämä johtuu siitä, että siinä on totipotentteja alkion kantasoluja, jotka voivat lisääntyä ja erilaistua erityyppisiksi soluiksi - B- ja T-lymfosyyteiksi, makrofageiksi, erytrosyyteiksi, verihiutaleiksi ja osteoklasteiksi. Juuri näitä soluja käytetään useiden perinnöllisten sairauksien hoitoon, mukaan lukien jo mainittu vakava yhdistetty immuunipuutos, Gaucherin tauti, sirppisoluanemia, talassemia, osteoporoosi jne.

Totipotenttien luuytimen kantasolujen lisäksi, joita on vaikea eristää ja viljellä, hyperkolesterolemian hoitoon käytetään napanuoraveren kantasoluja (suositeltu käyttö vastasyntyneen geeniterapiassa) sekä maksasoluja - hepatosyyttejä.

In vivo -geeniterapiassa on erityisen tärkeää varmistaa terapeuttisen geenin toimittaminen viallisiin soluihin. Tällainen kohdennettu kuljetus voidaan saada aikaan modifioiduilla vektoreilla, jotka perustuvat viruksiin, jotka kykenevät infektoimaan tietyntyyppisiä soluja. Harkitse jo edellä mainittua kystisen fibroosin hoitoon kehitettyä lähestymistapaa. Koska keuhkot ovat avoin ontelo, niihin on suhteellisen helppoa toimittaa terapeuttisia geenejä. Terveen geenin kloonattu variantti vietiin inaktivoituun adenovirukseen (kuva 3.19). Tämän tyyppisen viruksen spesifisyys on, että se saastuttaa keuhkojen limakalvon ja aiheuttaa vilustumisen.

Riisi. 3.19. Kaavio adenovirukseen perustuvan vektorin saamiseksi

Retro- ja adenovirusten lisäksi geeniterapiakokeissa käytetään myös muun tyyppisiä viruksia, kuten Herpes simplex -virusta. Tämän kaksijuosteisen (152 kb) DNA-viruksen ominaisuus on sen kyky infektoida spesifisesti hermosoluja. Keskus- ja ääreishermostoon vaikuttavia geneettisiä sairauksia on monia – kasvaimia, aineenvaihduntahäiriöitä, hermostoa rappeuttavia sairauksia (Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti).

Herpes simplex -virus tyyppi I (HSV) on erittäin sopiva vektori tällaisten sairauksien hoitoon. Tämän viruksen kapsidi fuusioituu hermosolun kalvon kanssa ja sen DNA kuljetetaan ytimeen. Useita menetelmiä terapeuttisen geenin siirtämiseksi HSV-vektoreita käyttämällä on ehdotettu, ja koe-eläimillä on suoritettu onnistuneita testejä.

Virusvektoreilla on useita haittoja: korkea hinta, rajoitettu kloonauskapasiteetti ja mahdollinen tulehdusvaste. Joten vuonna 1999 adenovirusvektorin käyttöönoton aiheuttaman epätavallisen voimakkaan immuunivasteen seurauksena 18-vuotias vapaaehtoinen, joka osallistui lääketutkimuksiin, kuoli. Vuonna 2002 Ranskassa kahdelle lapselle kehittyi leukemiaa muistuttava sairaus immuunikatohoidon aikana (tuottamalla terapeuttisia geenejä kantasoluihin retroviruksia käyttämällä).

Siksi kehitetään ei-viraalisia geeninkuljetusjärjestelmiä. Yksinkertaisin ja tehottomin tapa on ruiskuttaa plasmidi-DNA:ta kudoksiin. Toinen lähestymistapa on kudosten pommittaminen kultamikrohiukkasilla (1-3 µm), jotka on konjugoitu DNA:han. Tällöin terapeuttiset geenit ilmentyvät kohdekudoksissa ja niiden tuotteet - terapeuttiset proteiinit - pääsevät verenkiertoon. Tämän lähestymistavan suurin haittapuoli on näiden proteiinien ennenaikainen inaktivointi tai tuhoutuminen veren komponenttien toimesta.

DNA voidaan toimittaa pakkaamalla se keinotekoiseen lipidikuoreen. Tällä tavalla saadut pallomaiset hiukkaset-liposomit tunkeutuvat helposti solukalvon läpi. Liposomeja, joilla on erilaisia ​​ominaisuuksia, on luotu, mutta toistaiseksi tällaisen kuljetuksen tehokkuus on alhainen, koska suurin osa DNA:sta on alttiina lysosomaaliselle hajoamiselle. Lisäksi geneettisen rakenteen kuljettamiseksi DNA-konjugaatteja syntetisoidaan erilaisten molekyylien kanssa, jotka voivat varmistaa sen turvallisuuden, kohdistetun toimituksen ja solun tunkeutumisen.

Viime vuosina on tehty intensiivisiä kokeita keinotekoisen 47. kromosomin luomiseksi, mikä mahdollistaisi suuren määrän geneettistä materiaalia, jossa on täydellinen sarja säätelyelementtejä yhdelle tai useammalle terapeuttiselle geenille. Tämä tekisi mahdolliseksi käyttää terapeuttisen geenin genomista varianttia ja siten varmistaa sen stabiilisuuden ja tehokkaan pitkäaikaisen ilmentymisen. Suoritetut kokeet ovat osoittaneet, että terapeuttisia geenejä sisältävän keinotekoisen ihmisen kromosomin luominen on varsin realistista, mutta vielä ei ole selvää, kuinka niin valtava molekyyli viedään kohdesolun ytimeen.

Geeniterapian suurimmat ongelmat vakavan immuunireaktion riskin lisäksi ovat terapeuttisen DNA:n pitkäaikaisen varastoinnin ja toiminnan vaikeudet potilaan kehossa, monien sairauksien monigeenisyys, mikä tekee niistä vaikean kohteen geenille. hoitoon ja riskiin käyttää viruksia vektoreina.

PÄÄLLÄ. Voinov, T.G. Volova

Terveys

Ajatus viallisten geenien korvaamisesta terveillä, joka alkoi aktiivisesti hankkia tieteellistä kuorta viime vuosisadan 1990-luvun alussa näytti antavan toivoa kaikkein toivottomille potilaille. Ensimmäisen vuonna 1990 tehdyn geeniterapiakokeen jälkeen tutkijoiden optimismi on kuitenkin jonkin verran heikentynyt - ja kaikki johtuu geeniterapiamenetelmien toteuttamisessa ilmenneistä epäonnistumisista ja vaikeuksista. Geeniterapian tarjoamat mahdollisuudet Parkinsonin taudin, kystisen fibroosin, erilaisten syöpien ja monien muiden sairauksien hoitoon ovat kuitenkin todella rajattomat. Siksi tiedemiehet työskentelevät väsymättä yrittää voittaa kaikki geeniterapiaan liittyvät vaikeudet.

Mitä on geeniterapia?

Mitä geeniterapia sitten oikein on? Jotta tähän kysymykseen voidaan vastata, se on muistettava geenien päätehtävä kehossamme on säädellä proteiinien tuotantoa välttämätön kaikkien solujen normaalille toiminnalle ja terveydelle. Mutta jotkut geneettiset viat (geenivirheet) häiritsevät niiden päätoimintoa, jossain määrin estäen proteiinien tuotannon. Geeniterapian (geeniterapian) tavoitteena on viallisten geenien korvaaminen terveillä. Tämä auttaa luomaan vastaavan proteiinin lisääntymisen, mikä tarkoittaa, että henkilö paranee tietystä taudista.

Kun otetaan huomioon ihanteellinen kehitysskenaario, solut säädetyt deoksiribonukleiinihapon (DNA) molekyylit alkaa jakautua, tuottaen puolestaan ​​useita kopioita korjatusta geenistä, mikä antaa keholle mahdollisuuden päästä eroon geneettisestä poikkeavuudesta ja parantua kokonaan. Terveiden geenien vieminen sairaisiin soluihin (sekä yritykset korjata vastaavat poikkeamat) on kuitenkin erittäin monimutkainen prosessi, mikä on toistaiseksi harvoin onnistunut.. Siksi useimmat nykyajan tutkimukset pyrkivät kehittämään turvallisia ja luotettavia mekanismeja geenien viemiseksi vaurioituneisiin soluihin.

Geeniterapian tyypit: ex vivo ja in vivo -terapia

Geeniterapiaa voidaan suorittaa riippuen menetelmästä, jolla DNA viedään potilaan genomiin joko soluviljelmässä (ex vivo) tai suoraan kehossa (in vivo). Ex vivo -geeniterapiassa solut poistetaan potilaan kehosta, muunnetaan geneettisesti ja viedään sitten takaisin yksilön kehoon. Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen verisairauksien hoidossa, koska verisoluja voidaan poistaa ja laittaa takaisin melko helposti. Useimpien muiden sairauksien tapauksessa solujen poistaminen kehosta ja niiden palauttaminen takaisin sisään ei kuitenkaan ole helppoa. Esimerkiksi, geneettisistä syistä johtuvan sydänsairauden tapauksessa, tehokas toimenpide on ns. in vivo -geeniterapia, jossa geenimuutokset tehdään suoraan potilaan kehossa. Tämän toimenpiteen suorittamiseksi geneettistä tietoa toimitetaan suoraan soluun vektorin - nukleiinihappomolekyylin, käytetään geenitekniikassa geneettisen materiaalin siirtämiseen. Useimmissa tapauksissa tutkijat käyttävät tämän siirron suorittamiseksi viruksia, jotka eivät ole vaarallisia terveydelle ja elämälle.

Menetelmät geneettisen tiedon kuljettamiseksi soluun

Lukuisat tutkimukset osoittavat, että erilaisten virusten käyttö on erittäin tehokas ratkaisu, jonka avulla voit päästä läpi kehon immuunipuolustuksen ja infektoi sitten solut käyttämällä niitä viruksen levittämiseen. Tämän toimenpiteen suorittamiseksi geeniteknikot valitsivat sopivimmat virukset retrovirusten ja adenovirusten ryhmästä. Retrovirukset tuovat geneettistä tietoa ribonukleiinihapon (RNA) muodossa, DNA:n kaltaisena molekyylinä, joka auttaa käsittelemään DNA:han tallennettua geneettistä tietoa. Heti kun on mahdollista tunkeutua syvälle niin kutsuttuun kohdesoluun, RNA-molekyylistä saadaan kopio DNA-molekyylistä. Tätä prosessia kutsutaan käänteistranskriptioksi. Kun uusi DNA-molekyyli on kiinnitetty soluun, kaikki solun uudet kopiot sisältävät kyseisen muunnetun geenin.

Adenovirukset kuljettavat geneettistä tietoa välittömästi DNA:n muodossa, joka toimitetaan jakautumattomaan soluun. Siitä huolimatta nämä virukset toimittavat DNA:ta suoraan kohdesolun tumaan DNA ei sovi solun genomiin. Siten muunneltu geeni ja geneettinen informaatio eivät siirry tytärsoluihin. Adenoviruksilla suoritettavan geeniterapian etuna on, että geenejä on mahdollista viedä hermoston soluihin ja hengitysteiden limakalvoille, jälleen vektorin avulla. Lisäksi on olemassa kolmas geeniterapiamenetelmä, joka suoritetaan niin kutsuttujen adeno-assosioituneiden virusten kautta. Nämä virukset sisältävät suhteellisen pieni määrä geneettistä tietoa, ja niitä on paljon vaikeampi eliminoida kuin retrovirukset ja adenovirukset. Adeno-assosioituneiden virusten etuna on kuitenkin se, että ne eivät aiheuta ihmisen immuunijärjestelmän reaktiota.

Vaikeuksia käytettäessä viruksia geeniterapiassa

Suurin ongelma, joka liittyy menetelmään, jolla geneettistä tietoa viedään soluun virusten avulla, on se on erittäin vaikeaa hallita täysin geenien yhteyttä kohdesoluun. Tämä voi olla erittäin vaarallista, sillä ns. geenin ilmentyminen, joka voi muuttaa terveet solut syöpäsoluiksi, ei ole poissuljettu. Tällä hetkellä tämä ongelma on erityisen tärkeä retrovirusten käsittelyssä. Toinen ongelma joiden ratkaisua ei ole vielä mahdollista organisoida, johtuu siitä, että yksi geeniterapian käyttömenettely ei useimmiten riitä. Useimmat geeniterapiat on toistettava aika ajoin. Ja kolmanneksi, virusten käyttöä geneettisen tiedon kuljettamiseen soluun vaikeuttaa kehon immuunijärjestelmän reaktion riski. Tämä on myös erittäin vakava ongelma, varsinkin tapauksissa, joissa kun geeniterapiatoimenpiteet on toistettava toistuvasti, kun potilaan keho vähitellen sopeutuu ja alkaa taistella injektoituja viruksia vastaan ​​entistä tehokkaammin.

Geeniterapia: Tutkimus jatkuu

Jos puhumme menestyksestä, niin tällä hetkellä geeniterapia on erittäin tehokas toimenpide. niin sanotun yhdistetyn immuunivajavuuden hoidossa, joka liittyy X-kromosomigeeniin. Toisaalta on hyvin harvoja tapauksia, joissa geeniterapiaa on käytetty menestyksekkäästi tämän taudin hoitoon. Lisäksi hoito itsessään on riskialtista, sillä se voi aiheuttaa potilaille useita oireita, joita esiintyy leukemiaa sairastavilla ihmisillä. Tämän sairauden lisäksi on hyvin, hyvin harvoja tapauksia, joissa käytetään yhtä tehokasta geeniterapiaa, vaikka viimeaikaiset tutkimukset antavat toivoa geeniterapian varhaisesta käytöstä Niveltulehduksesta, aivosyövästä, sirppisoluanemiasta, verkkokalvon halkeamasta ja joistakin muista sairauksista kärsivien potilaiden hoitoon.

Osoittautuu, että on liian aikaista puhua geeniterapian käytännön soveltamisesta lääketieteessä. Kuitenkin, Tutkijat etsivät edelleen tapoja käyttää geeniterapiaa turvallisesti ja tehokkaasti, joka on suorittanut suurimman osan kokeista elävällä kudoksella, joka on siirretty kehosta keinotekoiseen ulkoiseen ympäristöön. Näiden kokeiden joukossa tutkimukset, joissa tutkijat yrittävät viedä keinotekoisen, 47. kromosomin kohdesoluun, ovat erittäin mielenkiintoisia. Viimeaikaiset tieteelliset havainnot ovat antaneet tutkijoille mahdollisuuden ymmärtää prosesseja paremmin esiintyy RNA-molekyylin viemisen aikana. Tämä on johtanut mekanismin kehittämiseen geenitranskription suppressoimiseksi (ns. geenin poisto), josta voi olla hyötyä Hamiltonin taudin hoidossa. Tiedemiehet raportoivat myös, että he ovat onnistuneet kehittämään tavan toimittaa geneettistä tietoa aivosoluille, mitä aiemmin ei voitu tehdä vektorilla, koska tämä molekyyli oli liian suuri tähän tarkoitukseen. Toisin sanoen tutkimus jatkuu, mikä tarkoittaa, että ihmiskunnalla on kaikki mahdollisuudet oppia taistelemaan sairauksia vastaan ​​geeniterapiamenetelmien avulla.