Positiv direkte Coombs-reaktion. Coombs test: kliniske og laboratoriemæssige aspekter

Coombs-reaktionen er en effektiv metode til påvisning af erytrocyt-antigener og anti-erythrocyt-antistoffer i humant blod i en indirekte agglutinationstest. Grundlaget for testen er brugen af ​​specifikke monoklonale reagenser baseret på klasse G-immunoglobuliner (IgG) til typebestemmelse af erytrocytantigener, efterfulgt af brugen af ​​Coombs antiglobulinserum (AGS) i anden fase.

AGS fremstilles ved at blande serum fra blodet fra forsøgsdyr immuniseret med humane G-klasse immunoglobuliner og monoklonale antistoffer til en af ​​komponenterne - C3D humant serumkomplement. AGS forårsager agglutination af erytrocytter sensibiliseret af specifikke antistoffer. I fravær af antistoffer på erytrocytter under påvirkning af AGS forekommer der ikke en positiv reaktion.

Indirekte Coombs-reaktion giver dig mulighed for at bestemme tilstedeværelsen af:

• erytrocytantigener påvist af IgG-reagenser ("ufuldstændige" antistoffer, f.eks. monoklonale reagenser anti-D, anti-FYa, anti-FYb);
• anti-erythrocyt-antistoffer af IgG-klassen.

Indirekte antiglobulintest: påvisning af erytrocytantigener

Vi præsenterer metoden til indirekte Coombs-reaktion ved hjælp af anti-D IgG coliclon som et eksempel.

1. Mærk et rent rør: angiv navnet på den person, der testes.
2. Dispenser 2 dråber (ca. 0,1 ml) anti-D IgG zoliclon i røret.
3. Tilsæt 2 dråber af en 5 % suspension af analyserede erytrocytter, der tidligere er vasket med saltvand. Bland testprøver med Zoliclone.
4. Inkuber blandingen i et vandbad eller i en inkubator ved 37°C i 30 minutter.
5. Tilsæt 5-10 ml saltvand til reagensglasset med en Pasteurpipette.
6. Centrifuger røret med en centrifugalacceleration på 1200 g ved 18 - 25 °C i et minut.
7. Fjern saltvandet.
8. Gentag vask af erytrocytter ved centrifugering 2-3 gange mere.
9. Tilsæt 2 dråber antiglobulinserum til blodcellepelleten og bland.
10. Centrifuger røret med en centrifugalacceleration på 1200 g i et minut ved en temperatur på 18 - 25 °C.
11. Tilsæt 3-5 dråber saltvandsopløsning ved hjælp af en dispenser eller en Pasteur-pipette.
12. Resuspender pelleten og vurder visuelt for agglutination. Udtalte agglutinater i bunden af ​​røret på baggrund af en klar opløsning indikerer påvisning af erytrocytantigen. En uigennemsigtig suspension af blodceller indikerer fravær af antigen.

Coombs reaktion: screening for isoimmune anti-erythrocytter antistoffer

Forenelighedsvurdering i henhold til AB0-systemet, påvisning af "kolde" antistoffer

1. Forbered en donorblodprøve:
   • læg 0,2 ml blod i reagensglasset med en automatisk dispenser;
   • vask erytrocytterne 3 gange i 5,0 ml saltvand;
   • resuspender pelleten i 3 - 4 ml LISS-opløsning med lav ionstyrke.
2. Mærk det andet rene rør: angiv navnet på modtageren og navnet på donoren.
3. Dispenser 0,1 ml af modtagerens serum i det mærkede rør ved hjælp af en automatisk dispenser.
4. Tilsæt 2 dråber 5% erytrocytsuspension i LISS-opløsning.
5. Centrifuger straks blandingen ved 1200 g ved 18-25°C i 15-20 sekunder.
6. Ryst røret let for at adskille sedimentet fra bunden. Vurder for tilstedeværelsen af ​​agglutinater. Tilstedeværelsen af ​​hæmolyse og/eller agglutinater betyder:
   • inkompatibilitet ifølge AB0-systemet;
   • tilstedeværelsen i patientens serum af "kolde" antistoffer af IgM- eller IgA-klassen, ikke specifikke for AB0-antigener.

Påvisning af "termiske" antistoffer

1. I fravær af hæmolyse og/eller agglutinater inkuberes røret i 10-15 minutter ved 37°C.
2. Centrifuger røret ved 1200 g i 15 - 20 sekunder ved stuetemperatur.
3. Ryst røret og kontroller for hæmolyse og/eller agglutinater i supernatanten. Et positivt resultat indikerer påvisning i patientens serum af "termiske" IgM-antistoffer mod donorens erytrocytantigener.

Påvisning af IgG-antistoffer i Coombs-testen

1. Hvis resultatet er negativt i sidste fase af undersøgelsen, tilsættes 5 ml 0,9 % NaCl-opløsning til reagensglasset med en Pasteur-pipette.
2. Centrifuger røret ved 1200 g i 15 - 20 sekunder ved en lufttemperatur på 18 - 25 °C. Kassér forsigtigt supernatanten med en Pasteurpipette.
3. Gentag RBC-vasken 2 til 3 gange mere.
4. Tilsæt 1 - 2 dråber antiglobulinserum til reagensglasset. Udfør grundig blanding.
5. Centrifuger røret ved 1200 g i 15 - 20 sekunder.
6. Bryd forsigtigt erytrocytsedimentet op og vurder visuelt resultatet af reaktionen. Påvisning af agglutination betyder tilstedeværelsen i patientens serum af IgG-antistoffer mod donorens erytrocytantigener.

Antistoffer placeret på overfladen af ​​erytrocytter, kan være både i statisk og i fri tilstand i blodplasma. Afhængigt af antistoffernes tilstand udføres en direkte eller indirekte Coombs-reaktion. Hvis der er grund til at tro, at antistoffer er fikseret på overfladen af ​​røde blodlegemer, udføres en direkte Coombs-test. I dette tilfælde består testen i et trin - tilføjes antiglobulinserum. Hvis der er ufuldstændige antistoffer til stede på overfladen af ​​røde blodlegemer, agglutination erytrocytter.

Indirekte reaktion

Den indirekte Coombs-reaktion forløber i 2 trin. For det første er det nødvendigt at implementere kunstigt sensibilisering erytrocytter. For at gøre dette inkuberes erytrocytterne og blodserumet under undersøgelse, hvilket forårsager fiksering af antistoffer på overfladen af ​​erytrocytterne. Derefter udføres anden fase af Coombs-testen - tilsætning af antiglobulinserum.

udfældningsreaktion - RP (fra Lat praecipilo til bundfald) er dannelsen og udfældningen af ​​et kompleks af et opløseligt molekylært antigen med antistoffer i form af turbiditet, kaldet bundfald. Det dannes ved at blande antigener og antistoffer i ækvivalente mængder, et overskud af en af ​​dem reducerer niveauet af dannelse af immunkomplekset. Fældningsreaktionen sættes i reagensglas (ringfældningsreaktion), i geler, næringsmedier osv. Varianter af fældningsreaktionen i en halvflydende gel af agar eller agarose er meget udbredt, dobbelt immundiffusion iflg. Ouchterlony, radium immundiffusion, immunelektroforese og osv.

HLA-tastning- undersøgelse af det vigtigste menneskelige histokompatibilitetskompleks - HLA-kompleks. Denne formation inkluderer en region af gener på kromosom 6, der koder for HLA-antigener involveret i forskellige immunresponser.

Opgaver kl HLA-tastning kan være meget forskellige - biologisk identifikation (HLA-typen nedarves sammen med forældregener), bestemmelse af disposition for forskellige sygdomme, udvælgelse af donorer til organtransplantation - i dette tilfælde sammenlignes resultaterne af HLA-typning af donor- og modtagervæv. Ved hjælp af HLA-typebestemmelse bestemmes det, hvor ens eller forskellige ægtefæller er med hensyn til vævskompatibilitetsantigener for at diagnosticere tilfælde af infertilitet.

HLA-tastning foreslår HLA polymorfi analyse og udføres af to metoder - serologisk og molekylærgenetisk. Den klassiske serologiske metode til HLA-typebestemmelse er baseret på den mikrolymfocytotoksiske test, mens den molekylære metode anvender PCR (polymerasekædereaktion).

Serologisk HLA-tastning udført på isolerede cellepopulationer. Større histobæres hovedsageligt af lymfocytter. Derfor anvendes en suspension af T-lymfocytter som de vigtigste bærere af klasse I-antigener og en suspension af B-lymfocytter til bestemmelse af HLA-klasse II-antigener. Enten centrifugering eller immunomagnetisk separation bruges til at isolere de ønskede cellepopulationer fra fuldblod. Det menes, at den første metode kan føre til falsk-positive data, da nogle af cellerne dør i dette tilfælde. Den anden metode er anerkendt som mere specifik - mens mere end 95% af cellerne forbliver levedygtige.

Men grundlaget for at iscenesætte en lymfocytotoksisk test HLA-tastning er et specifikt serum, der indeholder antistoffer mod forskellige allelvarianter af HLA-antigener I- og II-klasser. Den serologiske test giver dig mulighed for at bestemme HLA-typen ved at undersøge, hvilke af seraene, der reagerer med lymfocytter, og hvilke der ikke gør.

Hvis der opstår en reaktion mellem celler og serum, dannes et antigen-antistofkompleks på cellens overflade. Efter tilsætning af en opløsning indeholdende komplement opstår lysis og celledød. Den serologiske test af HLA-typebestemmelse vurderes ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at vurdere positive (rød fluorescens) og negative (grøn fluorescens) reaktioner eller fasekontrastmikroskopi for at farve kernerne af døde celler. Resultatet af HLA-typebestemmelse er afledt under hensyntagen til specificiteten af ​​de reagerede sera og krydsreagerende antigenergrupper, intensiteten af ​​cytotoksicitetsreaktionen.

Ulemperne ved serologisk HLA-tastning er tilstedeværelsen af ​​krydsreaktioner, svag antistofaffinitet eller lav ekspression af HLA-antigener, fravær af proteinprodukter i en række HLA-gener.

Mere moderne, molekylære metoder HLA-tastning Der anvendes allerede standardiserede syntetiske prøver, som ikke reagerer med antigener på overfladen af ​​leukocytter, men med DNA og direkte indikerer, hvilke antigener der er til stede i prøven. Molekylære metoder kræver ikke levende leukocytter, enhver menneskelig celle kan studeres, og et par mikroliter blod er nok til at virke, eller det kan begrænses til at skrabe fra mundslimhinden.

Molekylær genetisk HLA-tastning bruger PCR-metoden, hvor det første trin er at opnå rent genomisk DNA (fra fuldblod, leukocytsuspension, væv).

Derefter kopieres DNA-prøven - amplificeres i et reagensglas ved hjælp af primere (kort enkeltstrenget DNA) specifikt for et specifikt HLA-locus. Enderne af hvert primerpar skal være strengt komplementære til en unik sekvens svarende til en bestemt allel, ellers sker der ingen amplifikation.

Efter PCR opnås ved gentagen kopiering et stort antal DNA-fragmenter, som kan vurderes visuelt. For at gøre dette underkastes reaktionsblandingerne elektrolyse eller hybridisering, og det bestemmes, om der er sket en specifik amplifikation ved hjælp af et program eller en tabel. Resultatet af HLA-typning præsenteres i form af en omfattende rapport på gen- og allelniveau. På grund af standardiseringen af ​​de anvendte prøver er molekylæren HLA-tastning mere præcist serologisk. Derudover giver det mere information (flere nye DNA-alleler) og et højere detaljeringsniveau, da det giver dig mulighed for at identificere ikke kun antigener, men også allelerne selv, som bestemmer, hvilket antigen der er til stede på cellen.

immunlysereaktion. Reaktionen er baseret på specifikke antistoffers evne til at danne immunkomplekser med celler, herunder erytrocytter, bakterier, hvilket fører til aktivering af komplementsystemet langs den klassiske vej og cellelyse. Af immunlysereaktionerne anvendes hæmolysereaktionen oftest og sjældent bakteriolysereaktionen (hovedsageligt ved differentiering af kolera og koleralignende vibrio).

hæmolyse reaktion. Under påvirkning af reaktionen med antistoffer i nærvær af komplement bliver den uklare suspension af erytrocytter til en lys rød gennemsigtig væske - "lakblod" på grund af frigivelsen af ​​hæmoglobin. Ved opsætning af en diagnostisk reaktion af komplementfiksering (RCC) bruges hæmolysereaktionen som en indikator: for at teste tilstedeværelse eller fravær (binding) af frit komplement.

Lokal hæmolysereaktion i gel(Jerne-reaktion) er en af ​​varianterne af hæmolysereaktionen. Det giver dig mulighed for at bestemme antallet af antistofdannende celler. Antallet af celler, der udskiller antistoffer - hæmolysiner, bestemmes af antallet af hæmolyseplakker, der vises i en agargel indeholdende erytrocytter, en cellesuspension af det undersøgte lymfoide væv og komplement.

Immunfluorescensmetode

(RIF, immunofluorescensreaktion) - en metode til påvisning af specifik Ag (Ab) ved anvendelse af Ab (Ag) konjugeret med fluorochrom. Det har høj følsomhed og specificitet. Det bruges til ekspres d-ki-infektioner. sygdomme (identifikation af det forårsagende middel i forskningsmaterialet), samt til bestemmelse af antistoffer og overfladereceptorer og markører for leukocytter (immunfænotyping) og andre celler. Direkte I. m. består i behandlingen af ​​et vævssnit eller udstrygning fra patologisk materiale eller mikrobielt to-ry with-coy indeholdende specifikke antistoffer konjugeret med fluorochrom; lægemidlet vaskes for at fjerne ubundne antistoffer og undersøges under et fluorescerende mikroskop. I positive tilfælde vises et lysende immunkompleks rundt om objektets periferi. Kontrol er nødvendig for at udelukke uspecifik luminescens. På indirekte. Dem. i det første trin behandles et vævssnit eller udstrygning med et ikke-fluorescerende specifikt middel, i det andet trin med et selvlysende middel mod -globuliner fra det pågældende dyr, som blev påført i det første trin. I et positivt tilfælde dannes et lysende kompleks, bestående af Ar, Am til det og Am mod At (sandwichmetode). Ud over et selvlysende mikroskop, for at tage højde for RIF under cellefænotypning, laser celle sortering .

flowcytometri- en metode til optisk måling af parametrene for en celle, dens organeller og de processer, der finder sted i den.

Teknikken består i at detektere spredningen af ​​lys fra en laserstråle, når en celle passerer gennem den i en væskestråle, og graden af ​​lysspredning gør, at man kan få en idé om cellens størrelse og struktur. Derudover tager analysen højde for niveauet af fluorescens af kemiske forbindelser, der udgør cellen (autofluorescens) eller indført i prøven før flowcytometri.

Cellesuspensionen, der tidligere er mærket med fluorescerende monoklonale antistoffer eller fluorescerende farvestoffer, kommer ind i væskestrømmen, der passerer gennem flowcellen. Betingelserne er udvalgt sådan, at cellerne står på linje efter hinanden pga. den såkaldte. hydrodynamisk fokusering af en stråle i en stråle. I det øjeblik cellen krydser laserstrålen, registrerer detektorerne:

lysspredning ved små vinkler (fra 1° til 10°) (denne egenskab bruges til at bestemme størrelsen af ​​cellerne).

lysspredning i en vinkel på 90° (giver dig mulighed for at bedømme forholdet mellem kernen/cytoplasmaet samt cellernes heterogenitet og granularitet).

fluorescensintensitet i flere fluorescenskanaler (fra 2 til 18-20) - giver dig mulighed for at bestemme subpopulationssammensætningen af ​​cellesuspensionen osv.

En antiglobulintest designet til at påvise ufuldstændige anti-erythrocytter antistoffer blev foreslået af Coombs, Morant, Reis i 1945 og blev senere kaldt Coombs testen. Essensen af ​​denne metode ligger i det faktum, at antiglobulinserum indeholdende antistoffer mod humane immunglobuliner, når de reagerer med erytrocytter sensibiliseret med ufuldstændige antistoffer, fører til deres agglutination.

Afhængigt af om antistofferne er fikseret på overfladen af ​​røde blodlegemer eller er fri i blodplasmaet, anvendes en direkte eller indirekte Coombs-test.

En direkte Coombs-test udføres i tilfælde, hvor der er grund til at tro, at de røde blodlegemer, der undersøges, allerede er det in vivo er blevet sensibiliseret med passende antistoffer, dvs. den første fase af reaktionen - fikseringen af ​​antistoffer på overfladen af ​​erytrocytter - forekom i kroppen, og den efterfølgende tilføjelse af antiglobulinserum forårsager agglutination af sensibiliserede celler.

Ved hjælp af den indirekte Coombs-test påvises ufuldstændige antistoffer i testserumet. I dette tilfælde forløber reaktionen i to trin. Det første trin er inkubation af testerythrocytter med testserum, hvor antistofferne i testserumprøven fikseres på erytrocytoverfladen. Den anden fase er tilsætning af antiglobulinserum.

Indtil nu har Coombs-testen været meget brugt i laboratoriepraksis til diagnosticering af immunopatologiske tilstande, især ved autoimmun hæmolytisk anæmi, karakteriseret ved ødelæggelse af erytrocytter på grund af binding af cellemembranen til antistoffer og (eller) komponenter i komplement system. Med dens hjælp påvises tilstedeværelsen af ​​Ig G (normalt Ig G1 og Ig G3) på erytrocytmembranen, hvilket kan aktivere komplement og nogle gange komplement (C3d). Men i den akutte periode af sygdommen, på grund af ødelæggelsen af ​​erytrocytter, hvorpå et stort antal antistoffer blev fikseret, under en hæmolytisk krise, såvel som med en utilstrækkelig mængde antistoffer i det kroniske sygdomsforløb, en negativ direkte Coombs-test kan noteres.

Det skal understreges, at den indirekte Coombs-test fortsat er den bedste metode til individuel udvælgelse af transfusionsmedier, da den muliggør den mest nøjagtige bestemmelse af donorens og modtagerens individuelle kompatibilitet for erytrocytantigener.

En yderligere direkte antiglobulintest for tilstedeværelsen af ​​autoantistoffer anbefales ved undersøgelse af alle modtagere af organer og væv i prætransplantationsperioden og modtagere af hæmatopoietiske stamceller også efter transplantation.

Ud over immunhæmatologi og transfusiologi anvendes antiglobulintests i vid udstrækning til diagnosticering af en række patologiske tilstande: ved hæmatologiske sygdomme, herunder lymfoproliferative sygdomme, ved systemiske bindevævssygdomme, Sjögrens sygdom, kronisk aktiv hepatitis mv.

Coombs' test bruges aktivt i medicinsk genetik og retsmedicin til at bestemme overfladen af ​​erytrocytantigener.

Coombs-testen er en ret tidskrævende forskningsmetode, der kræver særlig omhu i implementeringen. Når du bruger det, er der nogle vanskeligheder forbundet, især med fortolkningen af ​​svagt positive reaktioner. Det er kendt, at falske svage positive eller negative reaktioner ved udførelse af Coombs-tests kan være resultatet af utilstrækkelig effektiv vask af erytrocytter, neutralisering af antiglobulinreagenset med spor af serum og kontakt med en ikke-affedtet overflade, hvorpå antiglobulin kan fikseres. miste sin aktivitet. En anden ulempe ved Coombs-testen er ustabiliteten af ​​antiglobulinreagenset, hvis fremstilling og opbevaring har visse egenskaber, hvilket også gør det vanskeligt at kvantificere hæmagglutinationsreaktionen med antiglobulinserum.

Derudover er undersøgelser udført af A. Holburn, D. Voak et al. , viste, at overdreven rystning under resuspension af røde blodlegemer suspension kan være årsagen til falsk negative resultater. Fejlagtige resultater ved udførelse af antiglobulintest kan også skyldes tilstedeværelsen af ​​en blanding af antikomplementære antistoffer i antiglobulinreagenset, især til C3d, C3c, C4c og C4d komplementkomponenter, som adsorberes på overfladen af ​​testerythrocytter under inkubation og danner udseendet af et positivt resultat.

Disse mangler kan let elimineres ved grundigt at vaske testprøverne og kontrollere reaktionsbetingelserne.

I det sidste årti er isotonisk saltvand med lav ionstyrke (LISS) blevet brugt til at reducere tiden og følsomheden af ​​den indirekte Coombs-test.

Den ubestridelige fordel ved antiglobulin-tests er ifølge en række forfattere deres høje følsomhed, som væsentligt overstiger opløsningen af ​​alternative forskningsmetoder, der bruges til at påvise ikke-agglutinerende antistoffer.

Vi sammenlignede opløsningen af ​​metoder til undersøgelse af blodsera for tilstedeværelsen af ​​ufuldstændige antistoffer ved hjælp af polyglucin, gelatine og antiglobulinserum. I løbet af undersøgelsen blev titere af ufuldstændige anti-D-antistoffer overvåget i 140 blodserumprøver fra isoimmune donorer ved hjælp af gelatine-, polyglucin- og indirekte antiglobulintest. Angivelse af disse metoder er udført i overensstemmelse med almindeligt anerkendte metoder.

Det viste sig, at med hensyn til deres opløsning er metoder til påvisning af erytrocytsensibilisering af anti-D-antistoffer arrangeret som følger: den mest følsomme er den indirekte Coombs-test, derefter gelatinetesten, og den mindst informative er polyglucintesten. Resultaterne opnået i denne serie af eksperimenter svarer fuldt ud til litteraturdataene, hvilket giver os mulighed for at konkludere, at følsomheden af ​​Coombs' tests er tilstrækkelig høj, hvilket gør det muligt med høj grad af sikkerhed at identificere tilstedeværelsen af ​​anti-erythrocyt antistoffer i kroppen, der ikke forårsager agglutination af røde blodlegemer.

Men i praksis med Coombs' test er der tilfælde, hvor ufuldstændige antistoffer ikke påvises, selvom det kliniske billede af sygdommen eller tidligere immunisering indikerer deres mulige tilstedeværelse. I sådanne tilfælde kan det antages, at mængden af ​​antistoffer ikke er tilstrækkelig til, at de kan udfældes af antiglobulinserumantistoffer.

Denne konklusion blev bekræftet af vores eget eksperiment, hvor der ved anvendelse af metoden til analytisk mikroelektroforese af celler blev tilstedeværelsen af ​​anti-D-antistoffer på testerythrocytter, som ikke blev påvist i den indirekte Coombs-test, fastslået. I denne serie af eksperimenter blev antiglobulinserum tilsat til erytrocytter, tidligere inkuberet med sera opnået fra blodet fra immuniserede donorer, i perioden med antistofgenese på farten, dvs. i den periode, hvor kendte metoder, herunder Coombs-testen, ikke påviste antistoffer i dem.

I de udførte undersøgelser var beviset for tilstedeværelsen af ​​ufuldstændige antistoffer på overfladen af ​​erytrocytter en statistisk signifikant ændring i den elektroforetiske mobilitet af sensibiliserede røde blodlegemer efter tilsætning af antiglobulinserum. Det skal bemærkes, at der efterfølgende blev påvist anti-D-antistoffer i blodserumet fra alle immuniserede donorer i den indirekte Coombs-test.

Gillerand et al. viste også, at antiglobulintest er karakteriseret ved en vis følsomhedstærskel: et positivt resultat noteres kun, når mindst 500 Ig G-molekyler er fikseret på overfladen af ​​en erytrocyt.

Derudover er der evidens i litteraturen for, at et muligt negativt Coombs-resultat kan skyldes den lave affinitet af antistoffer, der sensibiliserer røde blodlegemer, som et resultat af, at de let elueres fra overfladen af ​​røde blodlegemer under vask.

I lyset af ovenstående kan det konkluderes, at et negativt resultat af Coombs-testen i nogle tilfælde endnu ikke er bevis for fraværet af antistoffer fikseret på overfladen af ​​erytrocytter.

Det er kendt, at Coombs' reaktioner er meget specifikke og tillader påvisning af de fleste typer af ufuldstændige antistoffer. Men som nogle eksperimentelle data viser, kan antiglobulintest også være positive under ikke-immunologiske tilstande. E. Muirhead et al. på den anden dag efter administration af phenylhydrazin, blev hundene observeret at have en positiv Coombs-test. Et sådant hurtigt udseende af en positiv reaktion vidner mod dens immunologiske natur og er snarere forbundet med uspecifik adsorption af proteinet på overfladen af ​​erytrocytter.

M. Williams et al. fundet, at clavulansyre også kan forårsage en positiv reaktion, som ifølge forfatterne er forbundet med uspecifik adsorption af plasmaproteiner på erytrocytoverfladen. En lignende effekt blev observeret i behandlingen med cephalosporin-antibiotika.

Forfatterne af ovenstående undersøgelser understreger den ikke-immunologiske karakter af de opnåede positive resultater af Coombs' test og insisterer på, at disse stoffer er i stand til at forårsage modifikation af røde blodlegemers membraner, som et resultat af hvilke erytrocytter kan adsorbere proteiner (især, albumin), som normalt er til stede i blodplasma og ikke har egenskaber som antistoffer. Derudover er det muligt, at det er det xenobiotiske, adsorberet på celleoverfladen, der fungerer som bindeled mellem cellemembranen og plasmaproteiner.

For den korrekte fortolkning af resultaterne af opsætning af antiglobulintest bør det kvantitative forhold mellem unge og modne erytrocytter i perifert blod også tages i betragtning. Det blev fundet, at retikulocytter isoleret fra kroppen i perioden med forbedret erythronregenerering kan agglutineres af antiglobulinserum.

Positivt resultat af direkte antiglobulintest Det bruges også i forskellige patologiske tilstande ledsaget af forstyrrelser i immunsystemet, inflammatoriske processer, der fører til uspecifik adsorption af antistoffer af forskellig specificitet på erytrocytmembraner. Dette tyder på, at Ig G-molekyler ikke interagerer med specifikke erytrocytantigener, men kun fikseres på overfladen af ​​cellerne, der undersøges.

Det skal huskes, at når man indstiller Coombs-testen i tilfælde af sygdomme karakteriseret ved udvikling af dysproteinæmi eller forekomsten af ​​paraproteiner, skyldes et positivt resultat tilstedeværelsen på overfladen af ​​erytrocytter af proteiner, der ikke har egenskaberne som antistoffer, hvilket også indikerer utilstrækkelig specificitet af antiglobulintests med hensyn til arten af ​​det protein, der er påvist med deres hjælp.

Som vist af talrige undersøgelser er positive resultater af direkte og indirekte antiglobulintest således ikke et absolut bevis på tilstedeværelsen af ​​antistoffer, da positive reaktioner også kan observeres under forskellige patologiske tilstande, der ikke er forbundet med isosensibilisering eller autosensibilisering af kroppen. Derfor giver kun en sammenligning af resultaterne af flere immunoserologiske metoder med det kliniske billede af sygdommen os til fuldt ud at bedømme den udviklende patologiske proces.

En positiv indirekte antiglobulintest med en negativ direkte test indikerer normalt tilstedeværelsen af ​​frie alloantistoffer i testserumet, forbundet med tidligere blodtransfusioner eller graviditeter.

Coombs' test er ofte positiv under eksacerbation af paroxysmal natlig hæmoglobinuri; en positiv Coombs-test med anti-C3 og anti-C3dg er en markør for kold agglutinin sygdom.

I tilfælde, hvor der er høj risiko for at udvikle hæmolytisk sygdom hos den nyfødte, er resultaterne af direkte og indirekte antiglobulintests af stor betydning for diagnosticering (oftest under graviditet) og om nødvendigt dynamisk overvågning af udseende og forandring. i antistoftiter. Oftest er hæmolytisk sygdom hos den nyfødte forbundet med uforenelighed mellem moderen og fosteret for D-antigenet, sjældnere for antigenerne i AB0-systemet og endnu sjældnere for andre antigener (C, c, K osv.). De resulterende antistoffer la, der som regel er ufuldstændige antistoffer af Ig G-klassen, påvises tydeligt i en indirekte antiglobulintest. I denne sygdom er korrekt etableret titer og specificitet af påviste antistoffer af stor betydning, da der er en vis sammenhæng mellem niveauet af anti-erythrocyt-antistoffer i blodet hos en gravid kvinde og en mulig prognose for sværhedsgraden af ​​hæmolytisk sygdom.

Den indirekte Coombs-test er også påkrævet i klinisk praksis for at sikre sikker transfusionsbehandling. Dens implementering er en obligatorisk komponent i immunhæmatologiske undersøgelser af donorer og forskellige kategorier af modtagere samt rutineundersøgelser af alle patienter i medicinske institutioner, der kan have brug for en transfusion af blod og dets komponenter.

En indirekte antiglobulintest anvendes i følgende tilfælde:

For en mere nøjagtig bestemmelse af Rh-tilknytning (antigen D) med uklare resultater af bestemmelse af Rh-faktoren ved hjælp af andre metoder (polyglucin, gelatine, etc.);

At detektere svage erytrocytantigener (Kell, Duffy, Kidd, Lewis, etc. systemer) og antistoffer mod disse antigener;

Til påvisning og identifikation af alloimmune anti-erythrocyt-antistoffer, herunder antistoffer, der forårsager hæmolytiske post-transfusionsreaktioner;

At bestemme tilstedeværelsen af ​​immunantistoffer i AB0-systemet ved transfusionshæmolytiske komplikationer;

Som en kompatibilitetstest til individuel udvælgelse af transfunderet blod og dets komponenter.

Coombs-testen er således en vigtig diagnostisk test, der anvendes inden for forskellige medicinske områder (hæmatologi, obstetrik, reumatologi, transfusiologi, klinisk og laboratoriediagnostik osv.). Kendskab til egenskaberne ved Coombs-testen vil bidrage til at øge pålideligheden af ​​resultaterne og vil bidrage til den korrekte fortolkning af laboratoriedata.

Litteratur

1. Antistoffer. Metoder / udg. D. Cathy. — M.: Mir, 1991.

2. Bayramalibeyli I.E., Rahimov A.A., Gadzhiev A.B.. // Transfusionsbehandling af anæmi: lærebog. vejledning til læger. - M .: Prakt. medicin, 2005. - S. 105-106.

3. Volkova O.Ya., Fregatova L.M., Levchenko L.B.// Transfusiologi. - 2006. - Nr. 2. - S. 39-62.

4. Donskov S.I.// Blodgrupper i Rhesus-systemet: teori og praksis. - M.: VINITI RAN, 2005. - S. 180-186, 195.

5.Immunserologi (normative dokumenter) / komp. A.G. Bashlay, S.I. Donskov. — M.: VINITI RAN, 1998.

6.Forskning af blodsystemet i klinisk praksis / red. G.I. Kozintsa, V.A. Makarov. — M.: Triada-X, 1997.

7. Levin V.I. Til mekanismen for erythrodierese og erythropoiesis i perioden med akut posthæmorragisk anæmi: Ph.D. dis. … cand. honning. Videnskaber. - Minsk, 1968.

8. Rahimov A.A., Bairamalibeyli I.E.. // Grundlæggende om diagnosticering, forebyggelse og behandling af anæmi. - M .: GOU VUNMTs fra Sundhedsministeriet i Den Russiske Føderation, 2002. - S. 204-209.

9. Chumakova E.D.. // Faktiske problemer med hæmatologi og transfusiologi: materialer fra VI-kongressen for hæmatologer og transfusiologer i Republikken Belarus, Minsk, 24.-25. maj 2007 / red. A.I. Svirnovsky, M.P. Potapnev. - Minsk: Republikansk videnskabeligt og praktisk center for hæmatologi og transfusiologi, 2007. - S. 50.

10. Coombs R., Mourant A., Race R. // Lancet. - 1945. - Bd. 2. - S. 15.

11. Freedman J. // J. Clin. Pathol. - 1979. - Bd. 32. - S. 1014-1018.

12. Holburn A.M. kvalitetskontrol. Metoder i hæmatologi / udg. I. Cavill. - Edinburg: Churchill Livingstone, 1982. - Vol. 4. - S. 34-50.

13. Khan S.// CMAJ. - 2006. - Bd. 175, nr. 8. - S. 919.

14. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Bd. 63 (tillæg 7). - s. 719-721.

15. Komatsu F.// Nippon Rinsho. - 2005. - Bd. 63 (tillæg 7). - s. 716-718.

16. Molthan L., Reidenberg M.M., Eihman M.F.// New Engl. J. Med. -1976. — Bd. 277. - S. 123-125.

17. Muirhead E.E., LundeM., Brian S. // J. Lab. Clin. Med. -1954. — Bd. 44. - S. 902-903.

18. Rosse W.F.//Hosp. Prac. - 1995. - N 105.

19. Voak D., Downie D., Mooreb. et al. //Biotests Bull. - 1986. - Bd. 1. - S. 41-52.

20. Voak D., Haigh T., Downie D. et al. Cellevaskemaskiner til antiglobulintests. Replikattest - en ny metode, der demonstrerer ineffektiviteten af ​​en meget brugt maskine - Sorvall CW1-AF2: rapport til DHSS Technical Branch, februar 1991.

21. Williams M.E., Thomas D., Harman C.P. et al. //Antimikrobielle midler og kemoterapi. -1985. - S. 125-127.

22. Zarandona J.M., Yazer M.H. // CMAJ. - 2006. - Bd. 174, nr. 3. - S. 305-307.

Medicinske nyheder. - 2008. - Nr. 3. - S. 33-36.

Opmærksomhed! Artiklen henvender sig til speciallæger. Genudskrivning af denne artikel eller dens fragmenter på internettet uden et hyperlink til den originale kilde betragtes som en krænkelse af ophavsretten.

Coombs-testen er en specifik laboratorietest, der påviser antistoffer til stede i eller på overfladen af ​​et rødt blodlegeme. Denne procedure gør det muligt at diagnosticere immunsystemet, herunder hos nyfødte, samt identificere hæmolytiske transfusionsreaktioner. Coombs-testen bruges aktivt i retsmedicin og videnskabelig genetik til at bestemme erytrocytantigener. Overholdelse af alle regler for gennemførelse af en sådan analyse giver dig mulighed for at få det mest pålidelige resultat.

Formålet med antiglobulintesten

Den direkte Coombs-test giver dig mulighed for at opdage anti-erythrocyt-antistoffer, der er fikseret på røde blodlegemer. En positiv reaktion i en sådan undersøgelse indikerer udviklingen af ​​autoimmunitet.Det skal bemærkes, at et negativt resultat ikke udelukker tilstedeværelsen, da antistoffer ofte er i en fri form, det vil sige, at de ikke har nogen forbindelse med røde blodlegemer. I sådanne tilfælde er det tilrådeligt at udføre en indirekte Coombs-test, som giver dig mulighed for at bestemme autonome stoffer i

Hvordan udføres analysen?

venøs blodprøver fra patienten udføres om morgenen på tom mave, på trods af at der ikke blev fundet væsentlige faktorer, der påvirker det endelige resultat af en sådan test. Det er tilladt at opbevare materialet taget ved en temperatur på 2 til 8 ° C i højst syv dage. For at denne undersøgelse er så nøjagtig som muligt, skal fuldblod leveres til laboratoriet inden for de første to timer. Ideelt set bør Coombs-testen vise et negativt resultat, hvilket indikerer fraværet af hæmolytiske ændringer i kroppen.

Dechifrering af totalerne

Coombs-testen er en ret tidskrævende undersøgelsesmetode, der kræver omhyggelig og præcis ydeevne. Når du bruger en sådan test, kan der være nogle vanskeligheder, der er forbundet med forkert fortolkning af de endelige resultater på grund af den svage manifestation af positive reaktioner. Det skal bemærkes, at upålideligheden af ​​analysen - nemlig en positiv Coombs-test - kan være resultatet af ineffektiv vask af erytrocytter, kontakt med fedtstoffer
overflade, samt neutralisering af antiglobulinreagenser af komponenter

serum. En anden ulempe ved denne forskningsmetode er ustabiliteten af ​​det taget materiale, hvis opbevaring har visse funktioner.

Et falsk negativt resultat kan være forårsaget af overdreven rystning af RBC-suspensionen under resuspension. Fejlagtige resultater kan også skyldes tilstedeværelsen af ​​anti-komplementære antistofkontaminanter, der adsorberer under inkubation på overfladen af ​​de testede erytrocytter, hvilket resulterer i et positivt resultat. Hvis testprøverne vaskes grundigt, og reaktionsbetingelserne kontrolleres, kan disse mangler let elimineres, hvilket vil øge chancerne for at opnå de mest pålidelige indikatorer for Coombs-testen.

- en antiglobulintest, der har til formål at påvise i Rh-negativt blod ufuldstændige anti-erythrocyt-antistoffer mod Rh-faktoren - et specifikt protein, der er placeret på overfladen af ​​erytrocytterne i Rh-positivt blod. Der er to typer af denne test: direkte - påvisning af antistoffer på overfladen af ​​røde blodlegemer, indirekte - påvisning af antistoffer i blodserum. En direkte test udføres i diagnosticering og overvågning af behandlingen af ​​blodsygdomme: hæmolytisk anæmi, hæmolytisk sygdom hos den nyfødte og andre. En indirekte test udføres for at vurdere foreneligheden af ​​donorens og modtagerens blod under transfusion, samt for at bestemme tilstedeværelsen og risikoen for Rh-konflikt ved planlægning og håndtering af graviditet. Materialet til Coombs-testen er venøst ​​blod, undersøgelsen udføres ved metoder baseret på agglutinationsreaktionen. Normalt giver begge test et negativt resultat. Analysen udføres inden for en dag.

Coombs-testen er en klinisk undersøgelse af Rh-negativt blod, rettet mod at påvise antistoffer mod Rh-faktoren. Testen bruges til at identificere risikoen for at udvikle en Rhesus-konflikt og hæmolytiske reaktioner. I hver person indeholder overfladen af ​​erytrocytter et bestemt sæt antigener eller agglutinogener - forbindelser af forskellig art, hvis tilstedeværelse eller fravær bruges til at bedømme blodtypen og Rh-faktoren. Der findes mange typer antigener, i medicinsk praksis er agglutinogener A og B, som bestemmer blodgruppen, og agglutinogen D, Rh-faktoren, af den største praktiske betydning. Med en positiv Rh-faktor påvises D-antigener på den ydre membran af erytrocytter, med et negativt - nej.

Coombs-testen, som også kaldes en antiglobulintest, har til formål at påvise ufuldstændige anti-erythrocytter-antistoffer mod Rh-faktorsystemet i blodet. Antistoffer mod Rh-faktoren er specifikke immunglobuliner, der produceres i Rh-negativt blod, når der kommer erytrocytter med D-agglutinogener i. Dette kan ske, når blodet fra fosteret og den gravide blandes, hvor blodtransfusioner udføres uden forudgående blodtypebestemmelse. Coombs-testen findes i to versioner - direkte og indirekte. Når du udfører en direkte Coombs-test, detekteres antistoffer knyttet til overfladen af ​​røde blodlegemer. Undersøgelsen bruges til at bestemme årsagen til den hæmolytiske reaktion. Den indirekte Coombs-test har til formål at påvise anti-erythrocyt-antistoffer i blodplasma. Det er nødvendigt at bestemme kompatibiliteten af ​​donorens og modtagerens blod eller moderen og fosteret, det hjælper med at forhindre udviklingen af ​​Rhesus-konflikten og efterfølgende hæmolyse af røde blodlegemer.

Blod for begge varianter af Coombs-testen tages fra en vene. Analysen udføres ved agglutinationsmetoden under anvendelse af antiglobulinserum. Resultaterne af undersøgelsen bruges i hæmatologi til at identificere årsagerne til hæmolytiske reaktioner, ved kirurgi og genoplivning under blodtransfusioner, i obstetrik og gynækologi til overvågning af graviditeter hos kvinder med Rh-negativt blod.

Indikationer

Den direkte Coombs-test, som påviser antistoffer knyttet til overfladen af ​​røde blodlegemer, er ordineret til hæmolytiske reaktioner (ødelæggelse af røde blodlegemer) af forskellig oprindelse. Undersøgelsen er indiceret til primær autoimmun hæmolytisk anæmi, post-transfusion hæmolytisk anæmi, hæmolytisk sygdom hos nyfødte, hæmolyse af røde blodlegemer forårsaget af autoimmune, neoplastiske eller infektionssygdomme, samt indtagelse af medicin, for eksempel quinidin, methyldopa, procainamid . Den indirekte Coombs-test, som påviser antistoffer i blodplasmaet, bruges til at forhindre udviklingen af ​​Rhesus-konflikten. Det er indiceret til patienter som forberedelse til blodtransfusioner, såvel som til gravide kvinder med en negativ Rh-faktor, forudsat at den fremtidige far til barnet har en positiv Rh-faktor.

For at bestemme Rh-kompatibilitet administreres Coombs-testen ikke til patienter med Rh-positivt blod. I disse tilfælde er der allerede antigener på overfladen af ​​røde blodlegemer, produktionen af ​​antistoffer kan ikke udløses ved blodtransfusion eller indtrængen af ​​fosterblod i den gravides blodbane. Undersøgelsen er heller ikke indiceret til gravide kvinder, hvis begge forældre har en negativ Rh-faktor, en arvelig recessiv egenskab. Et barn i sådanne par har altid Rh-negativt blod, en immunologisk konflikt med moderen er umulig. I hæmolytiske patologier bruges antiglobulintesten ikke til at overvåge terapiens succes, da resultaterne ikke afspejler aktiviteten af ​​erytrocytødelæggelsesprocessen.

Begrænsningen af ​​Coombs-testen er kompleksiteten af ​​forskningsproceduren - for at opnå pålidelige resultater er det nødvendigt at overholde temperatur- og tidsbetingelser, reglerne for fremstilling af reagenser og biomateriale. Fordelen ved Coombs testen er dens høje følsomhed. Ved hæmolytisk anæmi forbliver resultaterne af denne test positive, selvom hæmoglobin, bilirubin og retikulocytter vender tilbage til det normale.

Forberedelse til analyse og indsamling af materiale

Materialet til at udføre Coombs-testen er venøst ​​blod. Der er ingen særlige krav til tidspunktet for blodprøvetagningen og til forberedelsen af ​​patienten. Som med enhver undersøgelse anbefales det at holde en pause efter at have spist i mindst 4 timer, og i de sidste 30 minutter for at stoppe med at ryge, træne og undgå følelsesmæssig stress. Det er også værd at diskutere med din læge på forhånd behovet for at stoppe med at tage medicin - nogle lægemidler kan forvrænge resultaterne af Coombs-testen. Blod tages med en sprøjte fra cubitalvenen, sjældnere fra en vene på håndryggen. Inden for få timer er materialet leveret til laboratoriet.

Ved udførelse af en direkte Coombs-test tilsættes antiglobulinserum til patientens blodserum. Efter noget tid undersøges blandingen for tilstedeværelse af agglutinater - de dannes, hvis der er antistoffer på de røde blodlegemer. Med et positivt resultat bestemmes en agglutinerende titer. Den indirekte Coombs-test består af flere trin. Først fikseres antistofferne i serumet på de injicerede erytrocytter under inkubation. Derefter tilsættes antiglobulinserum til prøven, efter et stykke tid bestemmes tilstedeværelsen og titeren af ​​agglutinater. Analyseperioden er 1 dag.

Normale resultater

Normalt er resultatet af den direkte Coombs-test negativ (-). Det betyder, at der ikke er antistoffer forbundet med røde blodlegemer i blodet, og de kan ikke være årsag til hæmolyse. Det normale resultat af den indirekte Coombs-test er også negativt (-), det vil sige, at der ikke er antistoffer mod Rh-faktoren i blodplasmaet. Når man forbereder en blodtransfusion for modtageren, betyder dette kompatibilitet med donorens blod, mens man overvåger graviditeten - fraværet af Rh-sensibilisering af moderen, en lav risiko for at udvikle en immunologisk konflikt. Fysiologiske faktorer, såsom kostvaner eller fysisk aktivitet, kan ikke påvirke resultatet af testen. Derfor, hvis resultatet er positivt, er en lægekonsultation nødvendig.

Diagnostisk værdi af analysen

Et positivt Coombs-testresultat udtrykkes kvalitativt, fra (+) til (++++), eller kvantitativt, i titere fra 1:16 til 1:256. Bestemmelse af koncentrationen af ​​antistoffer på erytrocytter og i blodserum udføres i begge typer prøver. Med et positivt resultat af den direkte Coombs-test detekteres antistoffer på den ydre membran af røde blodlegemer, hvilket fører til ødelæggelsen af ​​disse blodlegemer. Årsagen kan være en blodtransfusion uden forudgående typning - en hæmolytisk reaktion efter transfusion, samt neonatal erythroblastose, en hæmolytisk reaktion på grund af brug af lægemidler, primær eller sekundær autoimmun hæmolytisk anæmi. Sekundær ødelæggelse af erytrocytter kan være forårsaget af systemisk lupus erythematosus, Evans syndrom, Waldenströms makroglobulinæmi, paroxysmal kold hæmoglobinuri, kronisk lymfatisk leukæmi, lymfom, infektiøs mononukleose, syfilis, mycoplasmal lungebetændelse.

Et positivt resultat af den indirekte Coombs-test indikerer tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod Rh-faktoren i plasmaet. I praksis betyder det, at der er opstået Rh-sensibilisering, der er mulighed for at udvikle en Rh-konflikt efter infusion af donorblod under graviditeten. For at forhindre graviditetskomplikationer anbringes kvinder med et positivt Coombs-testresultat på særlige journaler.

Behandling af afvigelser fra normen

Coombs-testen refererer til isoserologiske undersøgelser. Dens resultater gør det muligt at identificere en hæmolytisk reaktion samt at bestemme kompatibiliteten af ​​blodet fra donoren og modtageren, moderen og fosteret for at forhindre udviklingen af ​​Rhesus-konflikten. Hvis resultatet af testen er positivt, er det nødvendigt at søge råd fra den behandlende læge - fødselslæge-gynækolog, hæmatolog, kirurg.