Drugi dolazak genske terapije. Genska terapija, ili kako uvesti DNK u ćeliju i izliječiti pacijente s ovom pojednostavljenom proizvodnjom kliničkog vektora koji nosi genetski materijal

Članak za konkurs "bio/mol/tekst": « Miša je rođen 12. februara kao zdravo dete. Ali sa 1,5 mjeseca počela sam primjećivati ​​da na svim fotografijama beba zauzima isti položaj, kao da su mu noge nepomične. U roku od nekoliko sedmica dijagnosticirana nam je, suosjećali i savjetovali da počnemo planirati drugo, zdravo dijete.". Zbog fatalne kombinacije gena, Misha je, kao i druga djeca sa ovom bolešću, bio primoran da se bori za svaki pokret tokom svog kratkog života. Borite se očajnički, svom snagom, ali na kraju izgubite. spinalna mišićna atrofija (SMA) jedna je od genetskih anomalija pred kojima je čovječanstvo još uvijek nemoćno. Međutim, napredak u genskoj terapiji koji medicinski svijet sada prati može učiniti i SMA i druge teške nasljedne patologije izliječivim. Štaviše, još uvijek su izlječive in utero.

Generalni pokrovitelj takmičenja je kompanija Diaem: najveći dobavljač opreme, reagensa i potrošnog materijala za biološka istraživanja i proizvodnju.

Pokrovitelj Nagrade publike bio je Medicinsko genetički centar.

"Knjiga" pokrovitelj takmičenja - "Alpina non-fiction"

Priroda griješi, čovjek ispravlja

Koncept genske terapije je elegantan i lijep, kao i svi genijalci. Sastoji se u donošenju zdravog genetskog materijala u ćeliju uz pomoć vektorskih sistema kako bi se njime zamenili „pogrešni“ geni povezani sa raznim bolestima (slika 1).

"Biomolekul" je već detaljno pisao o tome kakve mogućnosti genska terapija otvara u liječenju raka i nasljednih anomalija, posebno pigmentoznog retinitisa.

I ako se 80-ih godina prošlog stoljeća, kada se prilično glasno pričalo o genskoj terapiji, njena teorija mnogima izgledala kao nastavak scenarija za traku „Povratak u budućnost“, danas je postala stvarnost koja se otvara nove, zaista bezgranične perspektive.

Međutim, jasno je da genska terapija ima niz ograničenja, posebno kada su u pitanju nasljedne bolesti. Prije svega, patološki proces u takvim slučajevima može započeti čak i u maternici. U trenutku kada se bolest konačno dijagnostikuje – a to se ponekad dešava godinama nakon rođenja djeteta – može se razviti nepovratna oštećenja stanica i organa, što značajno sužava terapijske mogućnosti ili ih čak poništava.

Šansa za rješavanje ovog problema pojavila se zahvaljujući modernoj prenatalnoj dijagnostici, koja omogućava otkrivanje kromosomskih defekata već u ranim fazama trudnoće. Nakon prijema bilo kojeg fetalnog materijala invazivnim tehnikama, moguće je brzo i pouzdano dijagnosticirati genetske bolesti. A u slučajevima s hemoglobinopatijama, potreba za invazivnim manipulacijama potpuno nestaje: da bi ih se identificiralo, dovoljno je ispitati fetalnu DNK dobivenu iz krvnih stanica majke.

Moderne prenatalne dijagnostičke tehnike u kombinaciji s napretkom u genskoj terapiji pružaju jedinstvenu priliku da se ispravi "greška" prirode i intervenira u patološkom procesu čak i prije nepovratnog oštećenja stanica. Omogućiti liječenje raznih bolesti djeteta u maternici, ili barem obuzdati napredovanje bolesti, po svoj prilici može fetalna genska terapija, ili fetalna genska terapija.

Ideja o fetalnoj genskoj terapiji daleko je od nove: samo nekoliko godina nakon prvog pokušaja genske terapije kod odraslih, 1994. godine, istraživači su počeli ozbiljno raspravljati o korištenju inovativne tehnike u maternici. Danas, kada se liječenje genetskih bolesti u maternici gotovo pretvorilo iz fantastične perspektive u stvarnost, objavljeno je mnogo radova u kojima se detaljno proučava fetalna genska terapija i njene prednosti u odnosu na gensku terapiju odraslih.

prenatalno protiv postnatalno

Predviđajući pitanja o preporučljivosti intrauterine korekcije genetske anomalije, hajde da se odmah osvrnemo na prednosti fetalne genske terapije u odnosu na postnatalnu gensku terapiju.

Široke mogućnosti za uticaj na organe i sisteme

Poznato je da kod mnogih genetskih bolesti (na primjer, buloza epidermolize ili cistična fibroza) može biti prilično teško utjecati na glavne karike patološkog procesa gotovo odmah nakon rođenja. Korekcija mutantnih gena u fetusu u razvoju omogućava brzo povećanje populacije matičnih stanica, osiguravajući veliki broj transficiranih stanica i, kao rezultat, izražen terapeutski učinak.

Pojednostavljena proizvodnja kliničkog vektora koji nosi genetski materijal

Doziranje virusnog vektora kojim se prenosi genetski materijal zavisi od tjelesne težine. Zbog male veličine fetusa moguće je postići mnogo veću biodistribuciju vektora u istoj dozi kao i u toku genske terapije odraslih. Ovo štedi vrijeme i novac. Jednostavni uporedni podaci pomažu da se zamisli koliko su značajne uštede: na primjer, fetus u 14-16 sedmica gestacije (optimalni period za indukciju vektora) teži oko 100 g, dok je prosječna tjelesna težina odrasle osobe oko 60 kg.

Povećanje efikasnosti terapije zbog inferiornog imunološkog odgovora

Brojne studije su pokazale da humoralni imunitet na adenoviruse i adeno-asociirane viruse (AAV) (slika 2) određenih serotipova koji se obično koriste kao vektori može dovesti do neuspjeha ekspresije transgena. Ovo može postati jedna od kritičnih prepreka uspješnoj transplantaciji.

Približno 50% odraslih osoba sa stečenim imunološkim odgovorom na ove virusne vektore je u opasnosti. Ali čak i u odsustvu osjetljivosti, uvođenje vektora kod odraslih često dovodi do razvoja imunološkog odgovora koji smanjuje trajanje i razinu ekspresije transgena. Dakle, nakon intramuskularne injekcije adenovirusnog vektora sa proteinskim genom distrofin odrasli miševi s Duchenneovom mišićnom distrofijom razvijaju antitijela na distrofin, što je povezano sa značajnim smanjenjem efikasnosti ekspresije. Istovremeno, fetus u maternici je imunološki nezreo, što omogućava isporuku virusnog vektora i transgenog proizvoda bez ograničenja koje nameće imuni odgovor.

Očigledne prednosti fetalne terapije u odnosu na postnatalnu korekciju osiguravaju njenu veću efikasnost i svrsishodnost, posebno kod teških bolesti opasnih po život. Čak iu slučajevima kada se ne može postići potpuno izlječenje, fetalna genska terapija može utjecati na patološke veze bolesti, olakšavajući njen tok i poboljšavajući prognozu. I, stoga, upravo ona može postati jedina terapijska alternativa prekidu trudnoće za hiljade porodica. Štaviše, broj bolesti koje se potencijalno mogu kontrolisati uvođenjem fetalne genske terapije u kliničku praksu je zaista ogroman.

Izgledi i mogućnosti

Vjeruje se da fetalna genska terapija može kontrolirati mnoge opasne patologije. Samo mali dio njih prikazan je u tabeli 1.

Osim toga, neke od patologija za koje se može očekivati ​​da će se kontrolirati fetalnom terapijom uključuju:

• Poremećaji imunodeficijencije- Sindrom golih limfocita, hipoplazija hrskavice, Chediak-Higashi sindrom, hronična granulomatozna bolest, Kostmanov sindrom, nedostatak adhezije leukocita, Omennov sindrom, Wiskott-Aldrich sindrom.
• Hemoglobinopatije- Rh bolest, kongenitalna eritropoetska porfirija.
• Bolesti povezane s nedostatkom aktivnosti enzima, - Gaucherova bolest, Krabbeova bolest, metahromatska leukodistrofija, mukopolisaharidoze, Volmanova bolest, Niemann-Pickova bolest.
• Ostalo- kongenitalna diskeratoza, porodična hemafagocitna limfohistiocistoza, infantilna osteopetroza, Shwachman-Diamond sindrom itd.

Lista bolesti koje mogu biti "na ramenu" fetalne genske terapije je nevjerojatna: vjerojatno će ova tehnika omogućiti intervenciju u patološkim procesima uzrokovanim monogenim bolestima koje su ranije bile izvan kontrole osobe. Njihov broj, prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji, dostiže deset hiljada. Ipak, važno je uzeti u obzir postojanje brojnih ograničenja, a prije svega, rizike za majku i fetus povezane s intrauterinom genskom terapijom.

Strahovi i rizici

Specifični rizici prenatalnog transfera gena su fundamentalno različiti od rizika postnatalne genske terapije. To uključuje kratkoročne nuspojave i dugoročne postnatalne učinke. Njihova važnost je pogoršana činjenicom da, hipotetički, ekspresija fetalnih gena može imati nepredvidiv učinak na prenatalni i postnatalni razvoj.

Prije svega, sam postupak prijenosa izravno je povezan s povećanjem vjerojatnosti pobačaja, horioamnionitisa i prijevremenog porođaja. Studije su dokumentirale upalne odgovore na vektor, posebno infiltraciju jetre i nekrozu jetre u genskoj terapiji fetusa ovaca.

Uspjeh fetalne genske terapije može se neutralizirati fetalnim imunološkim odgovorom, a to nosi određene rizike za konačni rezultat. Humoralni i ćelijski odgovori na uvođenje vektora ili transgenog proteina kroz transduktorske sisteme ćelija mogu eliminisati produkte transfera ili izravnati transgensku ekspresiju. Istovremeno, studije su pokazale zavisnost snage imunog odgovora o gestacijskoj dobi. Nisu registrovani značajni imuni odgovori na uvođenje lentivirusnog vektora u ranom i srednjem stadiju trudnoće, dok je kod uvođenja adenovirusnog vektora u kasnijim fazama uočen jak humoralni odgovor na kapsidni antigen.

Jedan od izuzetno važnih problema fetalne genske terapije je potencijalni rizik koji nastaje kada se sekvence DNK donora prenesu na fetus. Budući da je integracija vektora u zametne ćelije vjerovatno nasumična, teoretski bi mogla imati katastrofalne posljedice za fetus. U stvari, dijete koje primi genetski materijal donora u maternici je rođeno kao mutant. Etička komponenta genske terapije uznemirava umove naučnika i teologa. Od rođenja najpoznatije ovce u istoriji nauke, poslednja ovca upozorava na opasnosti koje mešanje u Božji plan donosi čovečanstvu.

Drugi važan aspekt je mogućnost mutageneze u stanicama fetusa, što dovodi do defekta u nekom funkcionalnom genu, što u konačnici može uzrokovati novu, stečenu genetsku bolest ili maligni tumor. Njegova vjerovatnoća izgleda još stvarnija s obzirom na podatke iz studije na miševima, tokom koje je ekspresija gena kod embrionalnih miševa dala poticaj razvoju tumora jetre.

U tom kontekstu, rezultati dvije studije koje pokazuju razvoj ozbiljnih nuspojava nakon uspješne genske terapije za X-vezanu kombinovanu imunodeficijenciju možda nisu slučajni: u prvom slučaju zabilježena je manifestacija monoklonske limfoproliferativne bolesti, a u drugom , alfa/beta proliferacija T-ćelija. I u prvom i u drugom slučaju, retrovirusni vektor integriran je u neposrednoj blizini gena LMO2 u proliferirajućim T ćelijama.

Teoretski genska terapija ex vivo može biti sigurnije od in vivo vektor uvođenja fetusa. Iako to ne isključuje mogućnost mutageneze u stanicama koje su retrovirusno transducirane in vitro, uvođenje mutagena može se lakše odrediti i kontrolisati. Međutim, ove komplikacije se ne mogu u potpunosti isključiti.

Konačno, fetalna genska terapija povećava osjetljivost fetalnih stanica na transdukciju. Retrovirusna transdukcija niskog nivoa u progenitore zametnih ćelija uočena je u muškim i ženskim gonadama nakon intraperitonealne primene vektora na embrione ovaca i majmuna. Analiza faktora koji dovode do nenamjerne transdukcije pokazala je da osjetljivost fetalnog tkiva na nju ovisi o gestacijskoj dobi, s većim stopama transdukcije u ranoj trudnoći.

Sa stanovišta potencijalnih rizika, očigledno je da fetalna genska terapija može biti razuman tretman samo za teške genetske bolesti, za koje ne postoje druge mogućnosti za njihovo ispravljanje. A među njima je, naravno, i Gaucherova bolest, mogućnost intrauterine genske terapije prikazana je nedavno objavljenom studijom.

Prvo je krenulo: Gaucherova bolest

U julu 2018. magazin medicine prirode objavio je rezultate studije na miševima koju je vodio Simon Waddington ( Simon Waddington) sa Londonskog instituta za žensko zdravlje. Rezultati rada pokazali su efikasnost fetalne genske terapije u liječenju neurodegenerativnih bolesti, a posebno Gaucherove bolesti. Ovo je najčešći oblik među rijetkim nasljednim fermentopatijama, koji se temelji na nedostatku aktivnosti lizosomalnog enzima. glukoza cerebrozidaza(slika 3), uzrokovane mutacijama u genu glukozilceramidaza. Ovisno o prirodi mutacija, može se razviti teški neuropatski oblik bolesti, koji se manifestira od djetinjstva, ili oblik s postupnijim početkom i manje izraženim simptomima. Dok blaži oblici Gaucherove bolesti dobro reaguju na zamjensku terapiju, teži oblik je i dalje fatalan. Znakovi neizlječivog oblika Gaucherove bolesti pojavljuju se u prvim mjesecima života i uključuju progresivnu mišićnu hipotenziju, zakašnjeli i regresirani psihomotorni razvoj i druge neurološke znakove.

U svojoj studiji, Waddington i saradnici su pokazali da je intrakranijalna primjena adeno-asociranog virusnog vektora 9 (AAV9) mišjim embrionima 16. dana gestacije rezultirala povećanom ekspresijom glukozne cerebrozidaze, što je zaustavilo neurodegeneraciju. Istovremeno, aktivnost enzima u mozgu bila je uporediva sa onom kod zdravih miševa. Unatoč činjenici da je kod oboljelih glodara još uvijek dijagnosticiran upalni proces u mozgu, oni su se znatno bolje razvijali od miševa iz kontrolne grupe, koji su zbog težine bolesti morali biti eutanazirani dvije sedmice nakon tretmana.

Miševi liječeni fetalnom genskom terapijom živjeli su najmanje 18 sedmica, bili su plodni i pokretni. Zanimljivo je da je uvođenje vektora postnatalno također olakšalo tok bolesti, ali je bilo manje efikasno od prenatalne ekspresije.

Budući da je AAV9 mogao ući u mozak iz krvotoka, Waddingtonov tim je napravio još jedan eksperiment u kojem su ubrizgali značajno veću dozu vektora ne u mozak, već direktno u krv fetalnih miševa. Miševi se uglavnom nisu razlikovali od zdravih miševa nakon ekspresije, ali pošto je njihov životni vek bio samo 55 dana u eksperimentalnim uslovima, naučnici nisu mogli da izvuku zaključke o dugoročnoj efikasnosti intravenske genske terapije.

Waddingtonov eksperiment bio je najsloženiji do sada, tokom kojeg je na životinjama provedena fetalna genska terapija. Danas tim radi sa korporacijom Apollo Therapeutics, koji je okupio tri britanska univerziteta i tri velike farmaceutske kompanije. Waddington i kolege slijede novi cilj: ovog puta suočeni su s izazovom dobivanja pretkliničkih podataka i potencijalnog testiranja tretmana na ljudima. I dok skeptici razmišljaju o opsegu fetalne genske terapije kod ljudi, koji bi se mogao znatno suziti ne uključivanjem Gaucherove bolesti u prenatalne testove, Waddingtonov tim je spreman za budućnost. Budućnost u kojoj se djeca s Gošeovom bolešću, Duchenneovom, SMA i mnogim drugim rijetkim, ali danas, nažalost, neizlječivim bolestima mogu oporaviti.

Književnost

1. 12 metoda u slikama: genetski inženjering. Dio II: alati i tehnike;
Imuni odgovori na vektore genske terapije: utjecaj na funkciju vektora i efektorske mehanizme . Gene Ther. 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Imuni odgovor na distrofin pune dužine koji se isporučuje u Dmd mišić preko adenovirusnog vektora visokog kapaciteta. Molekularna terapija. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). In utero genska terapija i uređivanje genoma. Curr matične ćelije rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Najbolja praksa i istraživanje kliničkog porodništva i ginekologije. 22 , 203-218;
5. Sažetak sa frontova genske terapije. Nova strategija za neutralizaciju hemofilije;
6. Charles Coutelle. (2008). Zašto se mučiti?: Da li je genska terapija inutero vrijedna truda? . Molekularna terapija. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al (2005). Onkogeneza nakon isporuke nonprimate vektora lentivirusne genske terapije fetalnim i neonatalnim miševima. Molekularna terapija. 12 , 763-771;
8. Evropsko društvo za gensku terapiju (ESGT) Saopštenje za javnost, Bernd Gansbacher. (2003). Izvještaj o drugom ozbiljnom neželjenom događaju u kliničkom ispitivanju genske terapije za X-vezani teški kombinovani imunološki nedostatak (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al (2018). Fetalna genska terapija za neurodegenerativne bolesti dojenčadi. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Danas genska terapija konačno počinje da opravdava nade koje su joj se nekada polagale. U posljednjih šest godina, kao rezultat uvođenja specifičnih funkcionalnih gena u dijelove tijela pacijenta, bilo je moguće vratiti vid kod 40 pacijenata sa nasljednim sljepoćom. U borbi protiv različitih oblika leukemije postignuti su sjajni rezultati: od 120 ispitanika, nekoliko pacijenata je postiglo remisiju koja traje tri godine. Genska terapija je pokazala svoju efikasnost u borbi protiv hemofilije - nasljedne bolesti, koja ponekad dovodi do smrti pacijenta. Sada pacijent ne mora uzimati lijekove u visokim dozama koji povećavaju zgrušavanje krvi i imaju opasne nuspojave.

Pozitivni rezultati dočekani su s velikim entuzijazmom i zato što je genska terapija prekinuta prije 15 godina nakon prerane smrti Jessea Gelsingera, tinejdžera s rijetkim probavnim poremećajem. Imuni sistem mladića je tako burno reagovao na uvođenje stranog gena da organizam nije mogao da izdrži. Uspjeh genske terapije 1990-ih nije bio ni približno tako impresivan kao što se očekivalo.

Sve to nas je natjeralo da preispitamo neke od korištenih metoda i trezvenije procijenimo mogućnosti primjene genske terapije za otklanjanje različitih patologija. Morao sam se rastati od iluzija i vratiti se fundamentalnim istraživanjima. Prije svega, bilo je potrebno utvrditi uzrok mogućih nuspojava (poput onih koje su dovele do Gelsingerove smrti) i naučiti kako ih izbjeći. Trebalo je više pažnje posvetiti komunikaciji sa pacijentima i njihovim rođacima, kako bi odluka koju donose bila svjesna.

Prekretnica je nastupila prije šest godina nakon što je genska terapija izliječila osmogodišnjeg dječaka po imenu Corey Haas koji je patio od degenerativne bolesti oka. U početku, kao rezultat genskih manipulacija, protein koji nedostaje počeo je da se proizvodi u zahvaćenoj mrežnjači lijevog oka, a već četiri dana nakon operacije dječak je posjetio zoološki vrt i, na svoje neopisivo oduševljenje, shvatio da viđa plavo nebo i šareni baloni. Tri godine kasnije, slične manipulacije izvedene su i desnim okom. Sada Corey tako dobro vidi da može ići u lov sa svojim djedom.

Do sada genska terapija nije ušla u arsenal praktičara, ali postoji nada da će se to dogoditi u narednih deset godina. U Evropi je 2012. godine pokušano da se njime eliminiše retka, ali izuzetno bolna patologija, takozvani familijarni nedostatak lipoprotein lipaze. Očekuje se da će Sjedinjene Države dobiti odobrenje za korištenje genske terapije u medicini 2016. godine, a zatim će morati nadoknaditi ono što je izgubljeno u deset godina neaktivnosti.

Okrutno razočarenje

Neuspjesi koji su zadesili istraživače u ranim fazama primjene genske terapije u praksi jasno su pokazali koliko je teško predvidjeti sve posljedice unošenja stranih gena u organizam. Prečesto najsigurniji sistemi isporuke nisu dovoljno efikasni, a neki od najefikasnijih sistema isporuke su nesigurni: razvija se preaktivan imuni odgovor, kao što je bio slučaj sa Gelsingerom, ili se razvija leukemija.

Kako bi razumjeli šta izaziva nuspojave i kako smanjiti rizik od njih, genetičari su se fokusirali na pažljivo proučavanje najčešćeg sistema za isporuku gena: dizajniranje virusa koji djeluju kao mikroskopski špric za injekciju.

Prije svega, značajan dio virusne DNK je uklonjen kako bi se napravio prostor za gene koji su trebali biti uneti u tijelo pacijenta. (Ova procedura je istovremeno učinila virus nesposobnim da se replicira.) Transformirani virus koji nosi ciljne gene je ubrizgan u ispravan dio tijela, gdje ih je ubacio u odgovarajuće regije ćelijske DNK, ovisno o vrsti virusa.

Tokom perioda u kojem je Gelsinger volontirao u kliničkim ispitivanjima genske terapije, najčešći sistem isporuke stranih gena kod ljudi bili su adenovirusi, koji obično uzrokuju blage infekcije gornjih disajnih puteva. Prema istraživačima sa Univerziteta Pennsylvania, najbolji rezultat je injekcija virusa u jetru; tu se nalaze ćelije koje proizvode probavni enzim koji je nedostajao Gelsingeru. Funkcionalna kopija gena za ovaj enzim umetnuta je u inaktiviranu virusnu česticu i trilion takvih čestica je ubrizgano u jetru pacijenta.

Nažalost, neke od čestica dospele su ne samo u ćelije jetre, kao što je trebalo, već i u ogroman broj makrofaga - velikih ćelija, "čuvara" imunog sistema, kao i u dendritičke ćelije, obaveštavajući potonje. invazije stranih agenata. Imuni sistem je odmah počeo da uništava sve zaražene ćelije, a ovaj nasilni proces je na kraju ubio pacijenta.

Ozbiljnost imunološkog odgovora zadivila je istraživače. Nijedan od 17 drugih volontera nije imao ništa slično. Bilo je poznato da adenovirus može izazvati imuni odgovor, ali osim jednog majmuna kojem je ubrizgan adenovirus malo drugačiji od gore opisanog, Gelsingerov slučaj je bio jedinstven. "Ljudska populacija je mnogo heterogena od životinjske", kaže James Wilson sa Univerziteta Pennsylvania, koji je razvio sistem ciljane isporuke gena koji je korišten u Gelsingerovim kliničkim ispitivanjima. "A u našem slučaju, jedan pacijent u nečemu značajno drugačijem od ostalih." Možda se tragedija ne bi dogodila da je doza virusa bila manja - ne trilion čestica, već nekoliko milijardi. Nedostatak je bio i to što ni sam pacijent ni njegovi rođaci nisu bili obaviješteni o smrti majmuna u sličnim testovima, a niko nije znao kakvu bi odluku donio da je znao za incident.

Tragedija koja se dogodila Gelsingeru nije posljednja. Ubrzo je pokušano da se eliminiše još jedna patologija uz pomoć genske terapije - teška kombinovana imunodeficijencija XI (SCID-X1). Testovi su uključivali 20 djece; njih pet je dobilo leukemiju, a jedno dijete je umrlo. I opet, kriv je bio sistem isporuke, iako je u ovom slučaju korišten drugi vektor - retrovirus koji ubacuje ciljne gene direktno u ćelijsku DNK. Njihov tačan položaj u genomu neznatno varira, a ponekad se pale u blizini onkogena, što pod određenim uslovima dovodi do pojave raka.

Revizija tehnologije

Tragične posljedice upotrebe retro- i adenovirusa kao vektora natjerale su nas da se okrenemo drugim vektorima. Kao rezultat, odabrana su dva virusa.

Prvi od njih, adeno-associated virus (AAV), ne uzrokuje nikakve infekcije kod ljudi. Većina nas u jednom ili drugom trenutku u životu postane njen nosilac, i upravo zbog toga je malo vjerovatno da će imunološki sistem odgovoriti na njega kada djeluje kao vektor. AAV ima još jednu osobinu koja pomaže da se minimizira rizik od nuspojava: predstavljen je mnogim varijetetima (serotipovima), od kojih svaki preferira da inficira ćelije svog "vlastitog" organa ili tkiva. Dakle, za AAV2 su to oči, za AAV8 jetra, za AAV9 srčani mišić i mozak. Moguće je odabrati soj virusa koji je optimalan za ciljni dio tijela i minimizirati imunološki odgovor i druge neželjene efekte. Osim toga, AAVue ugrađuje svoj genetski materijal u genom ćelije domaćina i stoga ne može uzrokovati rak nasumično aktivirajući onkogene.

Adeno-asociran virus je prvi put testiran na sposobnost da isporuči genetski materijal ciljnim tkivima 1996. godine. Testovi su sprovedeni na dobrovoljcima koji boluju od cistične fibroze. Od tada je identificirano 11 serotipova virusa, a stotine sigurnih, selektivnih vektora su napravljene od njihovih komponenti. Vektori bazirani na AAV trenutno se testiraju za gensku terapiju kod patologija kao što su Parkinsonova i Alchajmerova bolest, kao i hemofilija, mišićna distrofija, zatajenje srca i sljepoća.

Drugi virus, iznenađujuće, je oslabljena verzija virusa ljudske imunodeficijencije, uzročnika AIDS-a. Zaboravimo na trenutak na njenu lošu reputaciju i zadržimo se na njenim prednostima kao vektoru. HIV je član roda Lentivirusa iz porodice rstrovirusa. Deluje na ćelije imunog sistema i – što je veoma važno – ne aktivira onkogene.

Ako uklonimo gene odgovorne za smrtonosno dejstvo HIV-a, onda ćemo dobiti odličan vektor sa širokim spektrom mogućnosti. Tako kaže Stuart Naylor, bivši naučni direktor engleske kompanije Oxford Biomedica. Za razliku od manjeg AAV-a, "neutralizovani" HIV je pogodan za prijenos nekoliko gena odjednom. Nije toksičan i ne izaziva imunološki odgovor. Lišeni sposobnosti da izazovu infekciju, lentivirusi se testiraju na mogućnost njihove upotrebe za uklanjanje različitih patologija, posebno adenoleukodistrofije. Do danas je nekoliko dječaka s ovom dijagnozom uspjelo da se vrati u školu zahvaljujući genskoj terapiji.

Paralelno sa kliničkim ispitivanjima koristeći HIV AAVn, radi se na modifikaciji starih virusnih vektora kako bi se mogli koristiti pod određenim okolnostima. Dakle, retrovirusi (osim HIV-a) su genetski modificirani tako da ne uzrokuju leukemiju.

Čak ni adenovirus, čija je upotreba dovela do Gelsingerove smrti, neće biti potpuno odbačena. Sada se ubrizgava samo u dijelove tijela gdje je malo vjerovatno da će izazvati imuni odgovor. Jedna od potencijalnih primjena je genska terapija za kserotomiju (suha usta) kod pacijenata izloženih zračenju zbog karcinoma glave i vrata. kod kojih su oštećene pljuvačne žlezde.

Nacionalni institut za zdravlje provodi kliničko ispitivanje (koji uključuje mali broj volontera) pristupa koji se zasniva na uvođenju u odgovarajuće ćelije gena koji posreduju u formiranju kanala za prolaz vode do pljuvačnih žlijezda. Budući da su potonji mali i manje-više izolirani, a doza virusa je 1.000 puta manja od Gelsingerove jednom primljene doze, vjerojatnost prejake imunološke reakcije je svedena na minimum. Virusne čestice koje nisu došle do ciljnih ćelija, prema programerima, trebale bi se uništiti u pljuvački, ispljunuti s njom ili progutati, što opet smanjuje rizik od razvoja imunološkog odgovora. Od 2006. godine ova metoda je značajno poboljšala stanje 11 pacijenata.

Nove mete

Ohrabreni uspjehom, medicinski genetičari proširili su obim genske terapije i uz njenu pomoć pokušali eliminirati nenasljedne genetske defekte.

Na primjer, Univerzitet Pensilvanije već koristi ovaj pristup u borbi protiv jednog od najčešćih karcinoma u djetinjstvu – akutne limfoblastne leukemije (ALL). Približno 20% djece s ovom dijagnozom ne pomaže konvencionalna kemoterapija.

Genska terapija u takvim slučajevima je posebno složena i oslanja se na upotrebu himernih antigenskih receptora (CAR). Poput himera iz starogrčke mitologije, koje se sastoje od dijelova tijela različitih životinja, ovi receptori su kompleks dvije komponente imunološkog sistema koji se inače ne nalazi u tijelu. T ćelije za koje je vezan stiču sposobnost da traže specifične proteine ​​koji se nalaze u ćelijama leukemije u većim količinama od normalnih ćelija i uništavaju abnormalne ćelije. Prvi ispitanici bili su odrasli pacijenti sa hroničnom leukemijom: rezultati su bili ohrabrujući. Ishod ispitivanja na bolesnoj djeci premašio je sva očekivanja.

Kada je Emily Whitehead u maju 2010. dijagnosticirana leukemija, imala je devet godina. Dva ciklusa hemoterapije nisu uspjela. U proleće 2012. godine dat je treći kurs koji je mogao da ubije odraslu osobu, ali je devojčica preživela, iako je dobila probleme sa bubrezima, jetrom i slezinom. Prema ljekaru Bruceu Levineu. "Emili je bila na ivici smrti."

Zatim su joj uzeli krv, izolovali T-ćelije i ubrizgali im lentivirus. u čiji genom su prethodno bili uključeni ciljni geni. Nakon ubrizgavanja himernih T ćelija natrag u tijelo pacijentice, njeno stanje je počelo naglo da se poboljšava. Tri nedelje kasnije, 25% T ćelija u njenoj koštanoj srži bilo je genetski modifikovano i počelo je da "lov" na ćelije raka. “U aprilu je djevojčica postala potpuno ćelava. - priseća se Levin, - a do avgusta je poprimila nekadašnji izgled i bila spremna za školu.

Modifikovane T ćelije verovatno neće raditi do kraja njenog života, ali se postupak uvek može ponoviti. U međuvremenu, ova zgodna djevojka guste smeđe kose nema ćelije raka. U jesen 2013. godine, nekoliko grupa medicinskih genetičara izvijestilo je o korištenju CAR tehnike za liječenje 120 pacijenata sa istim oblikom leukemije kao Emily Whitehead, kao i sa drugim oblicima. Pet odraslih i 19 od 22 djece otišlo je u remisiju.

izgledi

Sada se stručnjaci za gensku terapiju suočavaju sa još jednim izazovom: moraju dobiti odobrenje od Uprave za hranu i lijekove (FDA) da koriste svoj sistem vektora koji je sigurniji od svih u klinici. Potrebno je organizovati III fazu kliničkog ispitivanja u kojoj će biti uključena velika grupa volontera. To obično traje između jedne i pet godina. Do kraja 2013. godine, otprilike 5% od 2.000 ispitivanja doseglo je ovu fazu. Kreatori metode liječenja pacijenata oboljelih od Leberove bolesti (bilateralni gubitak vida zbog mutacije mitohondrijske DNK: osmogodišnji Haas je imao ovu patologiju) napredovali su dalje od drugih. Nekoliko desetina pacijenata je već uspjelo vratiti vid uz pomoć genske terapije.

Genska terapija je jedna od oblasti medicine koja se brzo razvija, koja uključuje liječenje osobe unošenjem zdravih gena u tijelo. Štoviše, prema znanstvenicima, uz pomoć genske terapije možete dodati gen koji nedostaje, ispraviti ga ili zamijeniti, čime ćete poboljšati funkcioniranje tijela na ćelijskom nivou i normalizirati stanje pacijenta.

Prema naučnicima, 200 miliona stanovnika planete danas su potencijalni kandidati za gensku terapiju, a ta brojka stalno raste. I veoma je zahvalno da je nekoliko hiljada pacijenata već primilo liječenje od neizlječivih bolesti u sklopu tekućih ispitivanja.

U ovom članku ćemo govoriti o tome koje zadatke genska terapija postavlja pred sebe, koje se bolesti mogu liječiti ovom metodom i s kojim problemima se naučnici suočavaju.

Gdje se koristi genska terapija?

U početku je genska terapija zamišljena za borbu protiv teških nasljednih bolesti kao što su Huntingtonova bolest, cistična fibroza (cistična fibroza) i neke zarazne bolesti. Međutim, 1990. godina, kada su naučnici uspjeli ispraviti defektni gen i, unevši ga u tijelo pacijenta, pobijediti cističnu fibrozu, postala je zaista revolucionarna na polju genske terapije. Milioni ljudi širom svijeta dobili su nadu za liječenje bolesti koje su se ranije smatrale neizlječivim. I iako je takva terapija na samom početku razvoja, njen potencijal je iznenađujući čak iu naučnom svijetu.

Tako su, na primjer, pored cistične fibroze, moderni znanstvenici postigli uspjeh u borbi protiv takvih nasljednih patologija kao što su hemofilija, enzimopatija i imunodeficijencija. Štaviše, genska terapija vam omogućava da se borite protiv nekih karcinoma, kao i srčanih patologija, bolesti nervnog sistema, pa čak i povreda, na primjer, oštećenja živaca. Dakle, genska terapija se bavi bolestima izuzetno teškog toka, koje dovode do rane smrti i često nemaju drugog tretmana osim genske terapije.

Princip genske terapije

Doktori koriste genetske informacije kao aktivni sastojak, ili, preciznije, molekule koji nose takve informacije. Ređe se za to koriste RNA nukleinske kiseline, a češće DNK ćelije.

Svaka takva ćelija ima takozvani "xerox" - mehanizam kojim prevodi genetske informacije u proteine. Ćelija koja ima ispravan gen i xerox radi bez greške je zdrava ćelija sa stanovišta genske terapije. Svaka zdrava ćelija ima čitavu biblioteku originalnih gena koje koristi za pravilan i koordiniran rad celog organizma. Međutim, ako se iz nekog razloga izgubi važan gen, takav gubitak nije moguće obnoviti.

To uzrokuje razvoj ozbiljnih genetskih bolesti, poput Duchenneove miodistrofije (sa njom pacijent napreduje do paralize mišića, a u većini slučajeva ne doživi 30 godina, umire od zastoja disanja). Ili manje fatalno. Na primjer, "lom" određenog gena dovodi do činjenice da protein prestaje obavljati svoje funkcije. A to uzrokuje razvoj hemofilije.

U svakom od ovih slučajeva u pomoć priskače genska terapija čiji je zadatak isporučiti normalnu kopiju gena bolesnoj ćeliji i staviti je u ćelijski „kopirni aparat“. U ovom slučaju će se poboljšati rad ćelije, a možda će se obnoviti i funkcioniranje cijelog organizma, zahvaljujući čemu će se osoba riješiti ozbiljne bolesti i moći će produžiti svoj život.

Koje bolesti liječi genska terapija?

Kako genska terapija zaista pomaže osobi? Prema naučnicima, u svijetu postoji oko 4.200 bolesti koje su rezultat neispravnog funkcionisanja gena. U tom smislu, potencijal ove oblasti medicine je jednostavno nevjerovatan. Međutim, mnogo važnije je ono što su doktori danas uspjeli postići. Naravno, na tom putu ima dovoljno poteškoća, ali i danas možemo izdvojiti niz domaćih pobeda.

Na primjer, savremeni naučnici razvijaju pristupe liječenju koronarne bolesti srca putem gena. Ali ovo je nevjerovatno česta bolest koja pogađa mnogo više ljudi nego urođene patologije. Na kraju, osoba koja je suočena sa koronarnom bolešću nalazi se u stanju u kojem mu genska terapija može postati jedini spas.

Štoviše, danas se uz pomoć gena liječe patologije povezane s oštećenjem centralnog nervnog sistema. To su bolesti kao što su amiotrofična lateralna skleroza, Alchajmerova bolest ili Parkinsonova bolest. Zanimljivo je da se za liječenje ovih bolesti koriste virusi koji imaju tendenciju da napadaju nervni sistem. Dakle, uz pomoć virusa herpesa, citokini i faktori rasta se isporučuju u nervni sistem, koji usporavaju razvoj bolesti. Ovo je izvrstan primjer kako se patogeni virus, koji obično uzrokuje bolest, obrađuje u laboratoriji, uklanja proteine ​​koji nose bolest i koristi se kao kaseta koja isporučuje ljekovite tvari u živce i na taj način djeluje za dobrobit zdravlja, produženje ljudskog života.

Još jedna ozbiljna nasljedna bolest je holesterolemija, koja dovodi do nemogućnosti regulacije holesterola u organizmu, usled čega se u organizmu nakupljaju masti, a povećava se rizik od srčanog i moždanog udara. Kako bi se nosili s ovim problemom, stručnjaci uklanjaju dio jetre od pacijenta i ispravljaju oštećeni gen, zaustavljajući daljnje nakupljanje kolesterola u tijelu. Nakon toga, korigirani gen se stavlja u neutralizirani virus hepatitisa, te se uz njegovu pomoć šalje natrag u jetru.

Pročitajte također:

Postoje i pozitivni pomaci u borbi protiv AIDS-a. Nije tajna da je AIDS uzrokovan virusom ljudske imunodeficijencije, koji uništava imuni sistem i otvara vrata tijelu za smrtonosne bolesti. Savremeni naučnici već znaju kako da promene gene tako da prestanu da slabe imuni sistem i počnu da ga jačaju da bi se suprotstavili virusu. Takvi geni se unose kroz krv, kroz njenu transfuziju.

Genska terapija djeluje i protiv raka, posebno protiv raka kože (melanoma). Liječenje takvih pacijenata podrazumijeva uvođenje gena sa faktorima tumorske nekroze, tj. geni koji sadrže antitumorski protein. Štoviše, danas se provode ispitivanja za liječenje raka mozga, gdje se bolesnim pacijentima ubrizgava gen koji sadrži informacije za povećanje osjetljivosti malignih stanica na korištene lijekove.

Gaucherova bolest je teška nasljedna bolest koja je uzrokovana mutacijom gena koji potiskuje proizvodnju posebnog enzima - glukocerebrozidaze. Kod osoba koje boluju od ove neizlječive bolesti, slezina i jetra su uvećane, a kako bolest napreduje, kosti počinju da se lome. Naučnici su već uspjeli u eksperimentima na uvođenju u tijelo takvih pacijenata gena koji sadrži informacije o proizvodnji ovog enzima.

A evo još jednog primjera. Nije tajna da slijepa osoba do kraja života gubi sposobnost percepcije vizualnih slika. Jedan od uzroka kongenitalnog sljepila je i takozvana Leberova atrofija, koja je, u stvari, mutacija gena. Do danas, naučnici su vratili vidne sposobnosti 80 slijepih ljudi koristeći modificirani adenovirus koji je isporučio "radni" gen u tkivo oka. Inače, prije nekoliko godina, naučnici su uspjeli izliječiti sljepoću za boje kod eksperimentalnih majmuna uvođenjem zdravog ljudskog gena u mrežnicu oka životinje. A nedavno je takva operacija omogućila izliječenje sljepoće za boje kod prvih pacijenata.

Zanimljivo je da je metoda dostavljanja informacija o genima pomoću virusa najoptimalnija, jer sami virusi nalaze svoje mete u tijelu (herpes virus će sigurno pronaći neurone, a virus hepatitisa jetru). Međutim, ovaj način isporuke gena ima značajan nedostatak - virusi su imunogeni, što znači da ako uđu u tijelo, imunološki sistem ih može uništiti prije nego što prorade, ili čak izazvati snažne imunološke reakcije tijela, samo pogoršanje zdravstvenog stanja.

Postoji još jedan način za isporuku genskog materijala. To je kružni DNK molekul ili plazmid. Savršeno se spiralno vrti, postajući veoma kompaktan, što omogućava naučnicima da ga "upakuju" u hemijski polimer i uvedu u ćeliju. Za razliku od virusa, plazmid ne izaziva imunološki odgovor u tijelu. Međutim, ova metoda je manje prikladna, jer 14 dana kasnije, plazmid se uklanja iz ćelije i proizvodnja proteina prestaje. Odnosno, na taj način se gen mora uvoditi dugo, dok se ćelija ne "oporavi".

Dakle, savremeni naučnici imaju dve moćne metode za isporuku gena do "bolesnih" ćelija, a čini se da je upotreba virusa poželjnija. U svakom slučaju, konačnu odluku o izboru određene metode donosi liječnik, na osnovu reakcije tijela pacijenta.

Problemi sa kojima se susreće genska terapija

Može se zaključiti da je genska terapija malo proučena oblast medicine koja je povezana s velikim brojem neuspjeha i nuspojava, a to je njen veliki nedostatak. Međutim, postoji i etičko pitanje, jer se mnogi naučnici kategorički protive miješanju u genetsku strukturu ljudskog tijela. Zato danas postoji međunarodna zabrana upotrebe zametnih ćelija u genskoj terapiji, kao i preimplantacionih zametnih ćelija. To se radi kako bi se spriječile neželjene promjene gena i mutacije kod naših potomaka.

Inače, genska terapija ne krši nikakve etičke standarde, jer je osmišljena za borbu protiv ozbiljnih i neizlječivih bolesti, u kojima je službena medicina jednostavno nemoćna. A to je najvažnija prednost genske terapije.
Čuvaj se!

Zdravlje

Koncept zamjene defektnih gena zdravim, koja je počela aktivno da dobija naučnu ljusku početkom devedesetih godina prošlog vekačinilo se da daje nadu najbeznadnijim pacijentima. Međutim, od prvog eksperimenta genske terapije, sprovedenog 1990. godine, optimizam među naučnicima je donekle smanjen – a sve zbog određenih neuspjeha i poteškoća u primjeni metoda genske terapije. Međutim, mogućnosti koje nudi genska terapija za liječenje Parkinsonove bolesti, cistične fibroze, raznih vrsta karcinoma i mnogih drugih bolesti su zaista beskrajne. Zato naučnici neumorno rade pokušavaju da prevladaju sve poteškoće koje im se javljaju na putu povezane sa genskom terapijom.

Šta je genska terapija?

Dakle, šta je zapravo genska terapija? Da bismo odgovorili na ovo pitanje, potrebno je podsjetiti na to glavna funkcija gena u našem tijelu je regulacija proizvodnje proteina neophodna za normalno funkcionisanje i zdravlje svih ćelija. Ali neki genetski defekti (defekti u genima) ometaju njihovu glavnu funkciju, u jednom ili drugom stepenu, sprečavajući proizvodnju proteina. Cilj genske terapije (genske terapije) je zamjenjujući defektne gene zdravim. To će pomoći da se uspostavi reprodukcija odgovarajućeg proteina, što znači da će osoba biti izliječena od određene bolesti.

S obzirom na idealan razvojni scenarij, ćelije sa prilagođene molekule deoksiribonukleinske kiseline (DNK)će se početi dijeliti, proizvodeći, zauzvrat, više kopija korigiranog gena, što će omogućiti tijelu da se riješi genetske anomalije i potpuno izliječi. Međutim, uvođenje zdravih gena u bolesne ćelije (kao i pokušaji ispravljanja odgovarajućih devijacija) je izuzetno složen proces, što je do sada retko bilo uspešno.. Zato je većina modernih istraživanja usmjerena na razvoj sigurnih i pouzdanih mehanizama za uvođenje gena u oštećene stanice.

Vrste genske terapije: ex vivo i in vivo terapija

Genska terapija, ovisno o načinu uvođenja DNK u genom pacijenta, može se provesti bilo u ćelijskoj kulturi (ex vivo) ili direktno u tijelu (in vivo). U slučaju ex vivo genske terapije, ćelije se uklanjaju iz pacijentovog tijela, genetski modificiraju, a zatim se ponovo unose u tijelo pojedinca. Ova metoda je posebno korisna u liječenju poremećaja krvi, jer se krvna zrnca vrlo lako mogu ukloniti i vratiti nazad. Međutim, u slučaju većine drugih bolesti, uklanjanje ćelija iz tijela i njihovo vraćanje u organizam nije nimalo lako. Na primjer, u slučaju srčanih bolesti uzrokovanih genetskim uzrocima efikasna mjera je takozvana in vivo genska terapija, kada se promjene gena provode direktno u tijelu pacijenta. Da bi se izvršio ovaj postupak, genetske informacije se dostavljaju direktno u ćeliju pomoću vektora - molekula nukleinske kiseline, koristi se u genetskom inženjeringu za prijenos genetskog materijala. U većini slučajeva, da bi izvršili ovaj prijenos, istraživači koriste viruse koji nisu opasni po zdravlje i život.

Metode za dostavljanje genetskih informacija u ćeliju

Brojna istraživanja pokazuju da je upotreba raznih virusa vrlo efikasno rješenje, što vam omogućava da prođete kroz imunološku odbranu tijela a zatim inficiraju ćelije, koristeći ih za širenje virusa. Za izvođenje ove procedure, genetski inženjeri su odabrali najprikladnije viruse iz grupe retrovirusa i adenovirusa. Retrovirusi donose genetske informacije u obliku ribonukleinske kiseline (RNA), molekule slične DNK koja pomaže u procesuiranju genetskih informacija pohranjenih u DNK. Čim je moguće prodrijeti duboko u takozvanu ciljnu ćeliju, kopija molekule DNK dobija se iz RNA molekula. Ovaj proces se naziva reverzna transkripcija. Kada se nova molekula DNK pričvrsti za ćeliju, sve nove kopije ćelije će sadržavati taj modificirani gen.

Adenovirusi prenose genetsku informaciju odmah u obliku DNK, koja se isporučuje u ćeliju koja se ne dijeli. Mada ovi virusi isporučuju DNK direktno u jezgro ciljne ćelije DNK se ne uklapa u genom ćelije. Stoga se modificirani gen i genetske informacije ne prenose na ćelije kćeri. Prednost genske terapije adenovirusima je u tome što je moguće uvesti gene u ćelije nervnog sistema i u sluzokožu respiratornog trakta, opet, pomoću vektora. Osim toga, postoji i treća metoda genske terapije, koja se provodi putem takozvanih adeno-asociranih virusa. Ovi virusi sadrže relativno mala količina genetskih informacija, i mnogo ih je teže eliminirati od retrovirusa i adenovirusa. Međutim, prednost adeno-asociranih virusa je u tome što ne izazivaju reakciju ljudskog imunološkog sistema.

Poteškoće pri korištenju virusa u genskoj terapiji

Glavni problem vezan za metodu dostavljanja genetskih informacija u ćeliju putem virusa je to izuzetno je teško potpuno kontrolisati vezu gena sa ciljnom ćelijom. Ovo može biti izuzetno opasno, jer nije isključena takozvana ekspresija gena, koja zdrave ćelije može pretvoriti u ćelije raka. U ovom trenutku, ovaj problem je posebno relevantan u borbi protiv retrovirusa. Drugi problem čije rješenje još nije moguće organizirati, leži u činjenici da jedna procedura za upotrebu genske terapije, najčešće, nije dovoljna. Većinu genetskih terapija potrebno je ponavljati s vremena na vrijeme. I, treće, upotreba virusa za isporuku genetskih informacija u ćeliju je komplikovana rizikom od reakcije imunološkog sistema tijela. Ovo je takođe izuzetno ozbiljan problem, posebno u slučajevima kada kada je potrebno ponovljeno ponavljanje postupka genske terapije, kako se tijelo pacijenta postepeno prilagođava i počinje se sve efikasnije boriti protiv ubrizganih virusa.

Genska terapija: Istraživanje se nastavlja

Ako govorimo o uspjehu, onda je u ovom trenutku genetska terapija izuzetno efikasna mjera. u liječenju takozvane kombinovane imunodeficijencije, vezan za gen za X hromozom. S druge strane, vrlo je malo slučajeva uspješnog korištenja genske terapije u liječenju ove bolesti. Osim toga, sam tretman je rizičan poduhvat, jer može izazvati niz simptoma kod pacijenata koji se nalaze kod osoba koje boluju od leukemije. Osim ove bolesti, vrlo je, vrlo malo slučajeva korištenja genske terapije koja bi bila jednako efikasna, iako nedavne studije daju nadu za ranu upotrebu genske terapije za liječenje pacijenata koji boluju od artritisa, raka mozga, anemije srpastih stanica, rascjepa mrežnice i nekih drugih stanja.

Pokazalo se da je prerano govoriti o praktičnoj primjeni genske terapije u medicini. Kako god, istraživači nastavljaju da traže načine da koriste gensku terapiju bezbedno i efikasno, nakon što je proveo većinu eksperimenata na živom tkivu prebačenom iz tijela u vještačko vanjsko okruženje. Među ovim eksperimentima, izuzetno su zanimljive studije u kojima naučnici pokušavaju da unesu veštački, 47. hromozom u ciljnu ćeliju. Nedavna naučna otkrića omogućila su naučnicima da bolje razumiju procese koji se dešavaju tokom uvođenja RNK molekula. To je dovelo do razvoja mehanizma za suzbijanje transkripcije gena (tzv. gen nockout), koji može biti od koristi u liječenju Hamiltonove bolesti. Naučnici također navode da su uspjeli razviti način za isporuku genetskih informacija moždanim stanicama, što se ranije nije moglo učiniti pomoću vektora, pošto je ovaj molekul bio prevelik za ovu svrhu. Drugim riječima, istraživanja se nastavljaju, što znači da čovječanstvo ima sve šanse da nauči kako se boriti protiv bolesti korištenjem metoda genske terapije.

14943 0

Utvrđivanje lokalizacije i slijeda gena čije mutacije uzrokuju specifične bolesti, kao i sama mutacija i savremene metode njenog testiranja, omogućavaju dijagnosticiranje bolesti u neo-, pa čak i prenatalnom periodu razvoja organizma. To omogućava ublažavanje manifestacije genetskog defekta uz pomoć liječenja lijekovima, dijetom, transfuzijom krvi itd.

Međutim, ovakav pristup ne dovodi do ispravljanja samog defekta i u pravilu se nasljedne bolesti ne mogu izliječiti. Situaciju dodatno komplikuje činjenica da mutacija jednog gena može imati različite posljedice na organizam. Ako mutacija gena uzrokuje promjene u aktivnosti enzima koji kodira, to može dovesti do nakupljanja toksičnog supstrata ili, obrnuto, do nedostatka spoja potrebnog za normalno funkcioniranje stanice.

Dobro poznati primjer takve bolesti je fenilketonurija. Uzrokuje ga mutacija gena za jetreni enzim fenilalanin dehidroksilazu, koji katalizira konverziju fenilalanina u tirozin. Kao rezultat, povećava se nivo endogenog fenilalanina u krvi, što uzrokuje nepravilno formiranje mijelinske ovojnice oko aksona nervnih ćelija centralnog nervnog sistema i, kao rezultat, tešku mentalnu retardaciju.

Ako mutacija utječe na strukturni gen proteina, onda to može dovesti do ozbiljnih poremećaja na nivou ćelija, tkiva ili organa. Primjer takve bolesti je cistična fibroza.

Brisanje gena koji kodira protein koji se zove transporter cistične fibroze dovodi do sinteze defektnog proteina (odsustvo fenilalanina 508) i poremećenog transporta jona klorida kroz ćelijske membrane. Jedan od najštetnijih efekata ovoga je da sluz koja oblaže i štiti pluća postaje nenormalno gusta. To otežava pristup ćelijama pluća i doprinosi nagomilavanju štetnih mikroorganizama. Ćelije koje oblažu disajne puteve pluća umiru i bivaju zamijenjene vlaknastim ožiljnim tkivom (otuda naziv bolesti). Kao rezultat toga, pacijent umire od respiratorne insuficijencije.

Nasljedne bolesti odlikuju se složenim kliničkim manifestacijama, a njihovo tradicionalno liječenje je uglavnom simptomatsko: za liječenje fenilketonurije propisuje se dijeta bez alanina, defektni proteini se zamjenjuju funkcionalnom intravenskom primjenom, a koštana srž ili drugi organi se transplantiraju radi kompenzacije. izgubljene funkcije. Sve ove mjere su po pravilu neefikasne, skupe, dugotrajne, a samo nekoliko pacijenata doživi starost. Stoga je razvoj fundamentalno novih vrsta terapije vrlo važan.

Genska terapija

Godine 1990. u SAD-u, dr W. French Andrson napravio je prvi pokušaj genske terapije za liječenje teške kombinovane imunodeficijencije (SCID) kod trogodišnje djevojčice Ashanti de Silva. Ova bolest je uzrokovana mutacijom gena koji kodira adenozanadenilazu (ADA). Nedostatak ovog enzima doprinosi akumulaciji adenozina i deoksiadenozina u krvi, čiji toksični učinak dovodi do smrti B- i T-limfocita u perifernoj krvi i, kao rezultat, imunodeficijencije.

Djeca sa takvom bolešću moraju biti zaštićena od bilo kakvih infekcija (čuvati u posebnim sterilnim ćelijama), jer svaka bolest može biti fatalna. Četiri godine nakon početka liječenja, dijete je pokazalo ispoljavanje normalno funkcionalne ADA i ublažavanje simptoma SCID, što joj je omogućilo da napusti sterilnu komoru i živi normalnim životom.

Time je dokazana temeljna mogućnost uspješne genetske terapije somatskih stanica. Od 90-ih godina. genska terapija se testira za niz genetskih bolesti, uključujući i ona teška kao što su hemofilija, AIDS, razne vrste malignih neoplazmi, cistična fibroza itd. Trenutno se transgenezom može izliječiti oko 10 ljudskih bolesti.

Raznolikost genetskih bolesti predodredila je razvoj mnogih pristupa genskoj terapiji. U ovom slučaju rješavaju se 2 glavna problema: način isporuke terapeutskog gena; metoda za pružanje ciljane isporuke ćelijama namijenjenim za korekciju. Do danas, svi pristupi genskoj terapiji somatskih ćelija mogu se podijeliti u dvije kategorije: ex vivo i in vivo terapija (slika 3.15).

Rice. 3.15. Šema genske terapije ex vivo (a) i in vivo (a)

In vivo genska terapija uključuje isporuku terapeutskog gena direktno u ćelije specifičnog tkiva pacijenta. Razmotrimo ove pristupe detaljnije.

Ex vivo genska terapija uključuje sljedeće korake:
1) dobijanje defektnih ćelija pacijenta i njihovo uzgajanje;
2) transfer željenog gena u izolovane ćelije transfekcijom terapijskog genskog konstrukta;
3) selekcija i rast genetski korigovanih ćelija;
4) transplantaciju ili transfuziju ovih ćelija pacijentu.

Upotreba vlastitih ćelija pacijenta osigurava da nakon što se vrate, pacijent ne razvije imuni odgovor. Procedura transfera genske konstrukcije mora biti efikasna i normalan gen mora biti stabilno održavan i kontinuirano eksprimiran.

Sredstva za prijenos gena koje je stvorila sama priroda su virusi. Da bi se dobili efikasni vektori za isporuku gena, uglavnom se koriste dve grupe virusa - adenovirusi i retrovirusi (slika 3.16). U genskoj terapiji koriste se varijante genetski neutraliziranih virusa.

Rice. 3.16. Virusi koji se koriste za stvaranje terapeutskih vektora

Rice. 3.17. Genetska mapa tipičnog retrovirusa (a) i retrovirusna vektorska mapa (a)

Po prijemu retrovirusnog vektora, u plazmid se ubacuje DNK pune dužine retrovirusa, uklanja se većina gag gena i gena pol i env, a umjesto njih "terapeutski" T gen i po potrebi , umetnuti su marker selektivni Rg gen sa sopstvenim promoterom (slika 3.17, b). Transkripciju T gena će kontrolirati isti jak promotor lokaliziran u 5'-LTR regiji.Na osnovu ove šeme stvoreni su različiti retrovirusni vektori i maksimalna veličina DNK umetaka od približno 8 kb.

Tako dobijeni konstrukt može se sam koristiti za transformaciju, ali je njegova efikasnost i naknadna integracija u genom ćelije domaćina izuzetno niska. Stoga je razvijena metoda za pakovanje RNK pune dužine retrovirusnog vektora u netaknute virusne čestice, koje visokom frekvencijom prodiru u ćeliju i zajamčeno će biti integrirane u genom domaćina. Za to je stvorena takozvana "pakovana" ćelijska linija. U dva različita dijela hromozoma ovih ćelija ušiveni su retrovirusni geni gag i pol-env, lišeni sposobnosti pakovanja zbog nedostatka + (84*+) sekvence (slika 3.18).

Rice. 3.18. Šema za dobijanje upakovanog virusnog vektora

Retrovirusi aktivno inficiraju samo stanice koje se brzo dijele. Za transfer gena, oni se tretiraju sa pročišćenim upakovanim česticama retrovirusnog vektora ili se kultivišu sa ćelijskom linijom koja ih proizvodi, a zatim se bira da odvoji ciljne i ćelije za pakovanje.

Transducirane ćelije se pažljivo proveravaju na nivo sinteze terapijskog genskog proizvoda, odsustvo retrovirusa sposobnih za replikaciju, odsustvo promena u sposobnosti ćelija da rastu ili funkcionišu.

Najpogodnije za gensku terapiju su ćelije koštane srži. To je zbog prisutnosti totipotentnih embrionalnih matičnih stanica u njemu, koje se mogu razmnožavati i diferencirati u različite tipove stanica - B- i T-limfocite, makrofage, eritrocite, trombocite i osteoklaste. Upravo se te ćelije koriste za liječenje niza nasljednih bolesti, među kojima su već spomenuta teška kombinirana imunodeficijencija, Gaucherova bolest, anemija srpastih stanica, talasemija, osteoporoza itd.

Pored totipotentnih matičnih ćelija koštane srži, koje je teško izolovati i kultivisati, za lečenje hiperholesterolemije koriste se matične ćelije iz krvi pupčane vrpce (poželjna upotreba za neonatalnu gensku terapiju), kao i ćelije jetre - hepatociti.

U in vivo genskoj terapiji, posebno je važno osigurati isporuku terapeutskog gena do defektnih stanica. Takvu ciljanu isporuku mogu obezbijediti modificirani vektori zasnovani na virusima sposobnim da inficiraju specifične tipove stanica. Razmotrite pristup razvijen za liječenje cistične fibroze koji je već spomenut. Budući da su pluća otvorena šupljina, relativno je lako dostaviti im terapeutske gene. Klonirana varijanta zdravog gena uvedena je u inaktivirani adenovirus (slika 3.19). Specifičnost ove vrste virusa je da inficira sluznicu pluća, izazivajući prehladu.

Rice. 3.19. Shema za dobivanje vektora na bazi adenovirusa

Osim retro- i adenovirusa, u eksperimentima genske terapije koriste se i druge vrste virusa, poput virusa Herpes simplex. Karakteristika ovog dvolančanog (152 kb) DNK virusa je njegova sposobnost da specifično inficira neurone. Postoje mnoge genetske bolesti koje pogađaju centralni i periferni nervni sistem - tumori, metabolički poremećaji, neurodegenerativne bolesti (Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest).

Herpes simplex virus tip I (HSV) je vrlo pogodan vektor za liječenje ovakvih bolesti. Kapsid ovog virusa spaja se sa membranom neurona i njegova DNK se transportuje u jezgro. Predloženo je nekoliko metoda za prijenos terapeutskog gena korištenjem HSV vektora i provedena su uspješna ispitivanja na eksperimentalnim životinjama.

Virusni vektori imaju nekoliko nedostataka: visoku cijenu, ograničen kapacitet kloniranja i mogući upalni odgovor. Tako je 1999. godine, kao rezultat neobično snažnog imunološkog odgovora na uvođenje adenovirusnog vektora, umro 18-godišnji volonter koji je učestvovao u ispitivanjima lijeka. Godine 2002. dvoje djece u Francuskoj razvilo je stanje nalik leukemiji tokom liječenja imunodeficijencije (uvođenjem terapeutskih gena u matične ćelije pomoću retrovirusa).

Stoga se razvijaju nevirusni sistemi za isporuku gena. Najjednostavniji i najneefikasniji način je ubrizgavanje plazmidne DNK u tkiva. Drugi pristup je bombardovanje tkiva zlatnim mikročesticama (1-3 µm) konjugovanim sa DNK. U ovom slučaju, terapeutski geni se eksprimiraju u ciljnim tkivima i njihovi proizvodi - terapeutski proteini - ulaze u krvotok. Glavni nedostatak ovog pristupa je prerana inaktivacija ili uništavanje ovih proteina komponentama krvi.

DNK se može dostaviti pakovanjem u umjetnu lipidnu ljusku. Ovako dobijene sferne čestice-liposomi lako prodiru kroz ćelijsku membranu. Stvoreni su liposomi različitih svojstava, ali je do sada efikasnost takve isporuke niska, jer je većina DNK podvrgnuta lizozomskoj degradaciji. Također, da bi se isporučio genetski konstrukt, DNK konjugati se sintetiziraju s različitim molekulima koji mogu osigurati njegovu sigurnost, ciljanu isporuku i penetraciju u ćeliju.

Posljednjih godina provode se intenzivni eksperimenti za stvaranje umjetnog 47. hromozoma, koji bi omogućio uključivanje velike količine genetskog materijala sa kompletnim setom regulatornih elemenata za jedan ili više terapeutskih gena. To bi omogućilo korištenje genomske varijante terapeutskog gena i time osiguralo njegovu stabilnost i efikasnu dugoročnu ekspresiju. Izvedeni eksperimenti su pokazali da je stvaranje umjetnog ljudskog hromozoma koji sadrži terapeutske gene sasvim realno, ali još nije jasno kako uvesti tako ogromnu molekulu u jezgro ciljne stanice.

Glavni problemi s kojima se susreće genska terapija, pored rizika od teške imunološke reakcije, su poteškoće dugotrajnog skladištenja i funkcioniranja terapijske DNK u tijelu pacijenta, multigeničnost mnogih bolesti, što ih čini teškom metom gena. terapija i rizik od korištenja virusa kao vektora.

ON. Voinov, T.G. Volova