05.03.2020
Рск микробиология. Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что специфический комплекс антиген - антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.
Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций особенно заболеваний* вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиямй и вирусами.
РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.
Первая система - о с н о в н а я состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.
Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т. е. готовый, иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.
Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным! Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз,- результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - «лаковая кровь»).
Компоненты реакции связывания комплемента:
Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь.
1.Антитело-сыворотка больного система
2. Комплемент - сыворотка морских свинок
3.Антиген - эритроциты барана
4.Антитело - гемолизин к эритроцитам барана
5.Изотонический раствор
Ввиду того что в РСК участвует большое количество сложныхкомпонентов, они должны быть предварительно оттитрованы ивзяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5или 0,25, реже по 0,2 мл. Соответственно весь опыт проводят вобъемах 2,5, 1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают болееточный результат). Титрование компонентов реакции проводят втом же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающиеингредиенты изотоническим раствором.
Подготовка ингредиентов
Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Сыворотку разводят 3 раза меньше ее титра (см. с. 211). Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте.
2.Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана (см. с. 211) на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37˚С.
3.Комплемент обычно разводят 1:10. перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента – это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1ч при 37˚С. Схеме титрования комплемента представлена в таблице 21.
Внимание! Титруют комплимент в таком же объеме, в каком ставят основной опыт, заменяя изотоническим раствором недостающие ингредиенты.
Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом – гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).
В приведенном в табл. 21 примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплимента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это – рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 комплемента в разведении 1:10. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должна быть взята в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора. Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора.
Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора) умножают на число пробирок, участвующих в РСК. Например, для проведения опыта в 50 пробирках нужно взять 10 мл комплемента 1:10 (0,2 млх50) и 15 мл изотонического раствора (0,3 млх50).
4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт беру количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Говорят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.
5. Антитело – сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56˚С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в разведении от 1:10 до 1:160.
Таблица №14
| Ингредиенты, мл | пробирки | |||||||||||
| опыт | контроль | |||||||||||
| Гемолитической системы | эритроцитов | |||||||||||
| Изотонический раствор | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Комплемент 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Гемолитическая система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% взвесь эритроцитов барана | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С 1 ч | ||||||||||||
| результат | Нет гемолиза | Гемолиз | Нет гемолиза |
Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производственных условиях и выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.
Все компоненты готовят с небольшим избытком.
| Ингредиенты, мл | Пробирки | |||||||
| Опыт контроль | ||||||||
| сыворотки | антигена | Гемолитической системы | Комплемент в рабочей дозе | |||||
| ½ | ||||||||
| Фаза 1 Изотонический раствор | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Испытуемая сыворотка в разведении 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Антиген а рабочей дозе | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Комплемент 1:10 в рабочей дозе | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С 45 мин 1ч или 4˚С 18 ч | ||||||||
| Фаза 2 гемолитическая система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С до полного гемолиза во 2, 3, 6 и 7 пробирках | ||||||||
| Результат | Положит. или отрицательный | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Таблица №15
Проведение основного опыта
При постановке опыта крайне; важна последовательность добавления компонентов. Опыт проводят в две фазы.
Фаза I. В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена, гемолитической системы и комплемента.
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37°С 45 мин- 1 ч или при 4 °С («РСК на холоде») 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса происходит связывание комплемента. Проведение реакции «на холоде» значительно повышает ее чувствительность и специфичность.
Фаза II. По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.
Учет результат о в. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в 2, 3, 6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, -следует немедленно вынуть штатив с пробирками из термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути (неполного гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находится только половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не может.
Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то, что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемент не связывают.
В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.
Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и воспрепятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном случае нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.
Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а во втором случае, будет гемолиз.
Интенсивность реакции выражают следующим образом:
Полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной;
Лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный;
Лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК;
Лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;
Лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК.
Оглавление темы "Реакции преципитации (РП). Иммуноэлектрофорез. Сложные реакции иммунодиагностики.":Сложные реакции иммунодиагностики. Реакция связывания комплемента (РСК). Феномен лаковой крови. Этапы, техника реакции связывания комплемента.
(РСК ) предложена Ж. Борде и О. Жангу . Реакция включает две фазы (рис. 10-18).
Рис. 10-18. Реакция связывания комплемента . А - отрицательная реакция. Специфические в отношении исследуемого Аг AT отсутствуют. Образования иммунных комплексов, связывающих комплемент, не происходит. Молекулы комплемента сорбируются на клетках-мишенях (эритроцитах), вызывая их лизис. Б - положительная реакция. Имеющиеся в сыворотке AT специфически связывают исследуемый Аг, образуя иммунный комплекс. Последний связывает комплемент, и лизиса эритроцитов не наблюдают.В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента (РСК) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.
В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента (РСК) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы - эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом. случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит-антиэритроцита рное AT. Следствие этого - гемолиз индикаторных клеток (феномен «лаковой крови») - реакцию считают отрицательной.
Если в фазе I реакции связывания комплемента (РСК) AT и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной. Основные недостатки РСК: сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов [их необходимо готовить прямо перед постановкой реакции (комплемент) либо за несколько суток (эритроциты барана)] и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Тем не менее РСК применяют в диагностике многих заболеваний, например при диагностике сифилиса (реакция Вассерманна).
Реакция связывания комплемента заключается в том, что соединение антигена с соответствующим ему антителом извлекает из свежей сыворотки и прочно удерживает (связывает) находящийся в ней комплемент. Применяется для обнаружения антител и определения природы антигенов. При отсутствии специфического сродства между антигеном и сывороткой адсорбция комплемента не происходит.
Для проведения этой реакции необходимы следующие ингредиенты:
- 3 или 5%-ная взвесь эритроцитов барана;
- гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
- комплемент в дозе, установленной титрованием; антиген, не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни его задержки, в дозе, установленной титрованием;
- испытуемая сыворотка, активированная при 56°С в течение 15–30 мин в водяной бане и разведенная 1: 5 или 1: 10; стерильный физиологический раствор (0,85%).
Эритроциты барана.
Эритроциты барана получают накануне постановки реакции пункцией яремной вены у барана в асептических условиях при помощи канюли. Кровь собирают в стерильную банку, содержащую стеклянные бусы, которые встряхивают для дефибринирования в течение 10–15 мин. После этого кровь фильтруют через несколько слоев марли и производят трехкратное отмывание эритроцитов в физиологическом растворе на центрифуге. Последняя порция промывной жидкости должна быть бесцветной.
Для постановки реакции применяется 1–3%-ная взвесь эритроцитов, которая готовится из 1 мл осадка отмытых эритроцитов + 33 мл физиологического раствора. В холодильнике эритроциты могут сохраняться пять-шесть дней. Для более длительного хранения их отмывают в жидкости Рингер-Локка следующего состава: NaCl – 9,0 г, КСl – 0,2 г, СаСl2 – 0,2 г, NaHСО3 – 1,0 г на 1 л дистиллированной воды. Жидкость стерилизуют паром в течение 30 мин, а затем добавляют 10 г кристаллической борной кислоты. На леднике эта жидкость может храниться две-три недели.
Консервировать эритроциты можно также и формалином, добавляя к 10 мл осадка эритроцитов 1 мл раствора формалина такого состава: 4 мл 40%-ного формалина на 200 мл физиологического раствора.
Гемолитическая сыворотка.
Для получения гемолитической сыворотки кроликам внутривенно вводят три-четыре раза 50%-ную взвесь бараньих эритроцитов по 2–5 млн. с интервалами в два-три дня. На шестой-седьмой день после окончания иммунизации проверяют титр сыворотки. Если он не ниже 1: 1200, у животного берут кровь из сердца или из краевой вены уха. После инактивации на водяной бане при 55° С в течение 30 мин сыворотку консервируют с добавлением к ней 1 % сухой борной кислоты. Для консервирования сыворотки можно применять равный объем стерильного глицерина, прогретого при 180° С в течение 15 мин или добавлять 1 мл смеси на 9 мл сыворотки такого состава – карболовой кислоты 5,5 мл + глицерина 20 мл +74,5 мл дистиллированной воды. Можно использовать также 0,05%-ный хинозол. Сыворотку надо хранить в запаянных пробирках на леднике.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме.
В ряд пробирок последовательно отмеряют по 0,5 мл полученных разведений, начиная с 1: 1000. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов, 0,5 мл разведенного 1: 10 комплемента и 1 мл физиологического раствора. Отмеривать разведения сыворотки надо градуированной пипеткой, начиная с последней пробирки, содержащей минимальное разведение сыворотки, чтобы не нарушить точности разведений.
Ниже приводим схему титрования гемолитической сыворотки.
Титром гемолитической сыворотки называется ее максимальное разведение, 0,5 мл которого может растворить 0,5 мл взвеси эритроцитов при наличии 0,5 мл (разведенного) комплемента в течение 1 час при соответствующей температуре.
Гемолитическую сыворотку (гемолизин, гемолитический амбоцептор по Эрлиху) можно приобрести в соответствующих снабжающих организациях. Она отпускается в ампулах, содержащих 1–2 мл и бывает годной к употреблению в течение шести месяцев. На ампулах указан титр, т. е. предельное разведение сыворотки, которая, будучи смешана с равным объемом (по 0,5 мл) 10%-ного комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси бараньих эритроцитов после 1-часового стояния в термостате. Титр сыворотки время от времени необходимо проверять. Для постановки основного опыта, а также для титрования антигена и комплемента применяют разведение, которое в три раза меньше титра. Например, если титр равен 1: 1200, берут разведение 1: 400 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 40 мл физиологического раствора).
После вскрытия ампулы оставшуюся сыворотку переливают в сухую стерильную пробирку и хранят на холоду.
Комплемент. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотках млекопитающих животных и особенно в сыворотке морской свинки. Вот почему в качестве комплемента и применяется активная сыворотка морских свинок.
Сыворотку получают при помощи пункции сердца у трехпяти здоровых небеременных и не подвергавшихся обработке человеческим белком морских свинок, смешивая отдельные порции вместе. После образования сгустка фибрина последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в ледник. На следующий день отсасывают прозрачную сыворотку, которая называется комплементом. Для реакции необходимо употреблять только тот комплемент, который получен накануне, так как активность его сохраняется на леднике один-два дня. Комплемент можно консервировать добавлением 4%-ной борной кислоты и 5%-ного сернокислого натрия в сухом виде. После растворения указанных веществ комплемент помещают на ледник. Перед каждым выполнением опыта производится титрование комплемента для определения так называемой рабочей дозы. Приготовляют при помощи градуированной пипетки основное разведение комплемента 1: 10 (1 мл комплемента + 9 мл физиологического раствора), которое разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл, после чего доводят объем каждой пробирки физиологическим раствором до 1,5 мл, помещая их затем в термостат. Через 15 мин к 3%-ной взвеси бараньих эритроцитов прибавляют равный объем гемолизина, взятого в тройном титре. После трехкратного переливания из одного сосуда в другой полученную смесь выдерживают еще 30 мин в термостате. После этого во все пробирки с разведениями комплемента добавляют по 1 мл гемолитической смеси, тщательно встряхивают и снова помещают в термостат на 30 мин. В качестве двух контролей применяют: 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл комплемента, разведенного 1: 10 + + 0,5 мл взвеси эритроцитов +1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется то минимальное его количество, при наличии которого 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре способно лизировать 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов в течение 30 мин при 37° С.
В связи с антагонистическим влиянием на комплемент других ингредиентов (антиген, гемолитическая сыворотка), участвующих в реакции, практически дозу комплемента надо увеличить на 20–35%, представляющую собой так называемую рабочую дозу. Так, при титре 0,25 рабочая доза будет составлять 0,3–0,33. Однако, при употреблении антигенов с заведомо антикомплементарной способностью необходимо определить рабочую дозу комплемента при наличии антигена по следующей схеме.
Если же антиген не обладает антикомплементарными свойствами, то рабочая доза комплемента остается той, которая была определена титрованием комплемента per se.
Пункции сердца у одной и той же свинки можно повторять много раз с промежутками три-четыре недели.
Антиген. Антиген готовят из бактериальной культуры. Наиболее простым антигеном является взвесь в дистиллированной воде или физиологическом растворе микробов, убитых нагреванием при 60° С в течение 1 час или при 100° С в течение 15– 20 мин.
В качестве антигена может применяться также микробная взвесь, убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для получения антигена, обработанного алкоголем, поступают таким образом: взвесь 24-часовой агаровой культуры, предварительно промытую физиологическим раствором, центрифугируют. Жидкость декантируют, а осадок заливают 95°-ным спиртом в соотношении 1: 5, после чего оставляют на два-три дня при комнатной температуре. После удаления алкоголя осадок микробов заливают физиологическим раствором и консервируют добавлением 1%-ной сухой борной кислоты. Для реакции исходную взвесь разводят по оптическому стандарту, содержащему 1 млрд. бактериальных тел в 1 мл, употребляя ее в количестве 0,5 мл в качестве антигена.
Микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате или после обработки антиформином, также могут служить антигеном.
Для получения антигена при обработке культуры антиформином необходимо к суточной агаровой культуре бактерий, смытой 1,5 мл физиологического раствора, добавить 2 мл 3–4%-ного антиформина, нейтрализованного по лакмусу с добавлением 4%-ной H2SO4. Хлор удаляют нагреванием лизата на водяной бане при 55–65° С в течение 30 мин под контролем йод-крахмальной бумажки, приобретающей под влиянием хлора чернофиолетовое окрашивание.
Диализированный бактериальный полисахарид, а также полный антиген, полученный по методу Буавена, обладают высокими антигенными качествами.
У антигенов, полученных различными методами, определяют титр, а также антагонистические свойства в отношении активности комплемента (антикомплементарность) и гемотоксичность – способности вызывать лизис эритроцитов в отсутствии сыворотки и комплемента.
Титром антигена называют его количество в 1 мл при общем: объеме реакции в 2,5 мл, при которой происходит отчетливый гемолиз. Антиген берут в количестве 0,5 мл. Для определения рабочей дозы в ряд пробирок отмеривают антиген в количестве от 0,1; 0,2 и т.д. до 0,5 мл, к которым добавляют физиологический раствор до 1 мл. Затем прибавляют по 0,5 мл разведения комплемента, содержащего рабочую дозу и 0,5 мл физиологического раствора, встряхивают и помещают на 1 час в термостат. После этого вынимают из термостата и отмечают пробирку с максимальным содержанием антигена, в которой наблюдается еще гемолиз. Количество антигена в этой пробирке является показателем растворяющей дозы антигена. Ориентировочная доза антигена, необходимая для дальнейшего испытания, составляет 1/2 или 2/3 растворяющей дозы. Для определения специфичности ее испытывают затем с заведомо положительными и отрицательными сыворотками. При успешном титровании антигена такого рода найденную дозу принимают за его титр, которым и пользуются для постановки реакции. Схема определения ориентировочной дозы антигена следующая.
Антикомплементарность устанавливают путем параллельных фильтрований комплемента per se при наличии антигена, который не должен подавлять активность комплемента больше чем на 30%, в противном случае он не годится для реакции.
Для определения гемотоксичности к 1 мл антигена, разведенного по титру, добавляют 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов и 1 мл физиологического раствора и помещают на 1 час в термостат. Отсутствие гемолиза указывает на отсутствие гемотоксических свойств антигена. Следует отметить, что все антигены бактериального происхождения (взвеси, лизаты, экстракты) перед опытом обязательно подвергаются титрованию, за исключением бактериального алкогольного антигена, который вообще способен долгое время сохранять свой титр. Кроме того, бактериальная взвесь определенной концентрации (например, 1 млрд. клеток в 1 мл по оптическому стандарту) также исключает необходимость титрования, так как 0,5 мл такой взвеси лишена антикомплементарных и гемотоксических свойств. Сохранять антигены следует на леднике.
Сыворотки. Для определения неизвестного антигена применяется специфическая иммунная сыворотка, полученная путем иммунизации кроликов и обладающая большей частью высоким титром. Полученная сыворотка инактивируется в водяной бане при 55–56° С в течение 30 мин. Инактивирование проводится с целью стабилизации коллоидов сыворотки. Такая сыворотка может сохраняться в леднике пять-шесть дней. Срок хранения ее увеличивается до двух-трех недель, если к инактивированной сыворотке добавить 2% сухой борной кислоты или смеси из 4% сухой борной кислоты и 5% кристаллического сернокислого натрия. Сыворотки хранят в запаянных ампулах.
Проведение реакции. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент таким образом, чтобы количество каждого ингредиента равнялось 0,5 мл. После тщательного встряхивания каждой пробирки штатив помещают в термостат на 1 час при 37° С. Через 30 мин после этого готовят гемолитическую систему, т. е. смешивают в равных объемах 3%-ную взвесь эритроцитов барана с разведенной по утроенному титру гемолитической сывороткой. Смесь помещают на 30 мин в термостат. По истечении указанного срока во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, тщательно перемешивают и помещают в термостат на 40–60– 120 мин в зависимости от времени появления гемолиза в контрольных пробирках, не содержащих антигена. Затем производится первое определение результатов опыта, после чего штатив помещают в ледник на 12–18 час или оставляют при комнатной температуре. По истечении этого срока учитывают окончательные результаты опыта.
При наличии полного гемолиза (лаковая кровь) во всех четырех пробирках, взятых для исследования сыворотки, результат считается отрицательным. При положительных результатах в первых трех пробирках наблюдается задержка гемолиза, а в четвертой (контроль сыворотки), не содержащей антигена, – полный гемолиз. Степень задержки гемолиза принято обозначать количеством крестов.
(++++) – полная задержка гемолиза (жидкость бесцветна, значительный осадок неизмененных эритроцитов);
(+++) – ясная задержка (жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов);
(++) – частичная задержка (жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов);
(+) – слабая задержка (жидкость интенсивно окрашена, незначительный осадок эритроцитов);
(±) – следы задержки (жидкость интенсивно окрашена, осадок в виде облачка);
(–) – полный гемолиз (жидкость интенсивно окрашена, отсутствие осадка, отрицательная реакция).
Приводим схему основного опыта.
РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител , комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит (задержка гемолиза ) , т.к. весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело, а эритроциты остались неизменными. При отсутствии в сыворотке антител , комплементарных антигену, специфический комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается не связанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая «лаковая» кровь.
Рис. 6. Схема РСК: а - индикаторная система (эритроциты барана и антитела к ним) в присутствии комплемента определяется в виде гемолиза; б - с сывороткой больного диагностикум (Аг) образует иммунные комплексы и активирует комплемент, результат - задержка гемолиза; в - в сыворотке здорового человека антител нет, комплемент активируется индикаторной системой, результат - гемолиз.
Реакции с применением меченных ат и аг
Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности. При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом. Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение . При непрямом РИФ используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген-антитело. Этот комплекс выявляется с помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к гаммаглобулиновой фракции крови того вида животного, от которого была получена диагностическая сыворотка. Светящийся комплекс выявляют при люминесцентной микроскопии.
Рис. 7. Реакция иммунофлюоресценции (схема).
Иммуноферментный анализ (ИФА) В основе иммуноферментного анализа лежит известная иммунная реакция антигена и антитела. Один из этих реагентов является определяемым веществом, а другой - узнающим, обладающим известной стандартной специфичностью (избирательностью) по отношению к определяемому веществу. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов (антиген-антитело) используется фермент , которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуализация присутствия вещества, определяемого методом ИФА, достигается применением посредника - хромогена . Это особое химическое соединение, которое хорошо растворимо в воде, и раствор которого бесцветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом.
Рис. 8. Иммуноферментный анализ (схема).
Аутоантигены - вещества, обладающие способностью вызывать иммунные реакции в организме, из которого они получены. Их содержат мозг, хрусталик глаза, сперматозоиды, паращитовидные железы, гомогенаты семенной железы, кожи, почек, печени и других тканей. Так как в обычных условиях аутоантигены не приходят в соприкосновение с иммунными системами организма, антитела к подобным клеткам и тканям не образуются. Однако при повреждении этих тканей аутоантигены могут всасываться и вызывать образование антител, оказывающих повреждающее действие на соответствующие клетки. Аутоантигены могут возникать также из клеток некоторых органов и тканей под влиянием охлаждения, медикаментозного воздействия, вирусных инфекций, бактериальных белков и токсинов, например стрептококков, стафилококков, микобактерии туберкулеза, и других факторов. Они образуются в этом случае вследствие нарушения видовой специфичности собственных антигенов организма.
Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (элитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.
Изотипы - детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и варианты каппа- и лямбда- легких цепей.
Аллотипы - детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.
Идиотипы - антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.
На долю класса IgG приходится около 75% общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.
Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут.
Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана +гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.
При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотки нет) - комплемент останется свободным и произойдет гемолиз.
РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонорее, сыпного тифа и других заболеваний.
Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела) соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).
Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.
1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченые ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н 2 О 2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.
2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.
В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.
ИФА применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях, в частности, ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов.
Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.
Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченный радиоизотопом, например I 125 . В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.
Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.
Контрольные вопросы
Приобретённый иммунитет, отличие его от наследственного (видового, врождённого). Виды приобретённого иммунитета.
Задача. В семье заболел дифтерией ребенок Валерий, трёх лет. Другие члены семьи не заболели, причём мать переболела дифтерией в детстве, а отец был привит дифтерийным анатоксином. Старшая сестра Наташа, пяти лет, в своё время не была привита дифтерийным анатоксином из-за медицинских противопоказаний, поэтому пришлось провести ей экстренную профилактику с помощью противодифтерийной антитоксической сыворотки. Младший брат, Виталий, трёх месяцев, не заболел, хотя ничем не был привит. В доме есть кошка и собака, они не заболели. Назовите для каждого из членов семьи и для животных вид иммунитета, благодаря которому они не заболели.
Что такое антиген? Какие вещества могут быть антигенами? Полноценные антигены и гаптены, чем они отличаются друг от друга? Структура антигена. Как называется часть молекулы антигена, определяющая его специфичность? Назовите известные Вам антигены. Что такое аутоантигены? Антигенное строение микробной клетки. Жгутиковые и соматические антигены; локализация, буквенное обозначение, химическая природа, отношение к температуре, способ получения, практическое применение. Анатоксин, его свойства, применение, получение. Какая ткань составляет иммунную систему организма? Укажите центральные и периферические органы иммунной системы человека. Опишите процесс формирования гуморального и клеточного иммунного ответа. Укажите клетки, которые осуществляют захват и переваривание антигена; клетки, которые взаимодействуют при формировании гуморального иммунитета, клеточного иммунитета; клетки, которые трансформируются и превращаются в плазмоциты, продуцирующие антитела; клетки, стимулирующие этот процесс; клетки, которые угнетают иммунный ответ; клетки, которые убивают опухолевые клетки, и заражённые вирусом клетки. Что такое антитела? Как получить иммунную сыворотку? Как получить сыворотку, которая бы нейтрализовала столбнячный токсин? Против каких антигенов образуются антитоксины, агглютинины, гемолизины? Какие антитела образуются при введении в организм дифтерийного анатоксина? дифтерийных бактерий? Химическая природа и структура антител. Что такое активный центр иммуноглобулина? Перечислите классы иммуноглобулинов, их свойства. Укажите класс иммуноглобулинов, способных проникать через плаценту. К какому классу относятся секреторные иммуноглобулины? Динамика накопления антител. Чем отличается вторичный иммунный ответ от первичного? Как в практической медицине используются знания о динамике иммунного ответа? Что такое реакции иммунитета, каков их механизм, фазы реакции. В каких 2-х направлениях используют реакции иммунитета? Перечислите реакции иммунитета.
Задача. Поставьте вместо пропущенных слов «анатоксин» или «антитоксин»: _________ является антигеном, _________ является антителом, __________ создаёт при введении в организм активный иммунитет, __________ создаёт при введении в организм пассивный иммунитет, __________ получают путём иммунизации животных, ___________ получают из токсина при воздействии формалином и теплом, ___________ нейтрализует токсины, __________ вызывает в организме образование антител.
Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителом; методы постановки, какие контроли ставятся и для чего; как должны выглядеть контроли. Агглютинирующие сыворотки, что они содержат, как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки? Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум? Реакции преципитации: что такое преципитация, что служит антигеном; как получить преципитирующую сыворотку? Что такое титр преципитирующей сыворотки? Методы постановки, практическое применение.
Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как ее получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента?
Задача. На одежде человека, обвиняемого в убийстве, обнаружено пятно крови. С помощью какой реакции можно определить, человеческая ли это кровь; что в этой реакции будет антигеном, и что антителами; какой диагностический препарат нужно иметь в лаборатории для этой реакции, как его приготовляют?
Задача. Как при помощи реакции преципитации определить, является ли доставленный для анализа образец мяса крупного рогатого скота или мясом лошади; какие необходимы диагностические препараты?
Реакция преципитации в агаровом геле, способы постановки, практическое применение.
