Mikrobiologija reakcija. Približna reakcija aglutinacije (RA)

1.1. REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Zbog svoje specifičnosti, lakoće postavljanja i demonstrativnosti, reakcija aglutinacije je postala široko rasprostranjena u mikrobiološkoj praksi za dijagnostiku mnogih zaraznih bolesti.

Reakcija aglutinacije zasniva se na specifičnosti interakcije antitijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama (aglutinogeni). Kao rezultat ove interakcije nastaju čestice - aglomerati koji se talože (aglutiniraju) u obliku pahuljica.

U reakciji aglutinacije mogu učestvovati i žive i mrtve bakterije, spirohete, gljive, protozoe, rikecije, kao i eritrociti i druge ćelije. Reakcija teče u dvije faze: prva (nevidljiva) je specifična, veza antigena i antitijela, druga (vidljiva) je nespecifična, vezivanje antigena, tj. formiranje aglutinata.

Aglutinat nastaje kada se jedan aktivni centar bivalentnog antitijela spoji sa determinantnom grupom antigena. Reakcija aglutinacije, kao i svaka serološka reakcija, odvija se u prisustvu elektrolita.

Izvana, manifestacija pozitivne aglutinacijske reakcije je dvostruka. Kod mikroba bez bičeva, koji imaju samo somatski O-antigen, same mikrobne ćelije se direktno spajaju. Takva aglutinacija se naziva sitnozrnasta. Javlja se u roku od 18 - 22 sata. v

Flagelirani mikrobi imaju dva antigena - somatski O-antigen i flagelarni H-antigen. Ako se stanice zalijepe zajedno sa flagelama, formiraju se velike labave pahuljice i takva reakcija aglutinacije naziva se krupnozrnasta. Dolazi u roku od 2 - 4 sata.

Reakcija aglutinacije može se postaviti kako u svrhu kvalitativnog i kvantitativnog određivanja specifičnih antitijela u krvnom serumu pacijenta, tako i u svrhu određivanja vrste izolovanog patogena. v

Reakcija aglutinacije se može podesiti kako u detaljnoj verziji, koja omogućava rad sa serumom razrijeđenim do dijagnostičkog titra, tako iu varijanti postavljanja indikativne reakcije, koja u principu omogućava otkrivanje specifičnih antitijela ili određivanje vrste patogena.

Prilikom postavljanja detaljne reakcije aglutinacije, radi otkrivanja specifičnih antitijela u krvnom serumu ispitanika, test serum se uzima u razrjeđenju 1:50 ili 1:100. To je zbog činjenice da u cijelom ili malo razrijeđenom serumu normalna antitijela mogu biti prisutna u vrlo visokim koncentracijama, te tada rezultati reakcije mogu biti netačni. Materijal za ispitivanje u ovoj varijanti reakcije je krv pacijenta.

Krv se uzima na prazan želudac ili ne ranije od 6 sati nakon obroka (u suprotnom, u krvnom serumu mogu biti kapljice masti koje ga čine zamućenim i neprikladnim za istraživanje). Krvni serum pacijenta se obično uzima u drugoj sedmici bolesti, uzimajući sterilno 3-4 ml krvi iz kubitalne vene (do tog vremena je koncentrisana maksimalna količina specifičnih antitijela). Kao poznati antigen koristi se dijagnostikum pripremljen od ubijenih, ali ne uništenih mikrobnih ćelija određene vrste sa specifičnom antigenskom strukturom.

Prilikom postavljanja detaljne reakcije aglutinacije kako bi se odredila vrsta, tip patogena, antigen je živi patogen izoliran iz test materijala. Poznata su antitijela sadržana u imuno dijagnostičkom serumu. v

Imunološki dijagnostički serum se dobija iz krvi vakcinisanog kunića. Nakon određivanja titra (maksimalnog razrjeđenja u kojem se detektiraju antitijela), dijagnostički serum se sipa u ampule uz dodatak konzervansa. Ovaj serum se koristi za identifikaciju prema antigenskoj strukturi izolovanog patogena.

OPCIJE REAKCIJE AGLUTINACIJE

U tim reakcijama učestvuju antigeni u obliku čestica (mikrobne ćelije, eritrociti i drugi korpuskularni antigeni), koji se slepe sa antitelima i talože.

Za uspostavljanje reakcije aglutinacije (RA) neophodne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen); 2) antitelo (aglutinin) i 3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).

INDIKATIVNA (PLOČA) REAKCIJA AGLUTINACIJE (RA)

Približni, ili lamelarni, RA se stavlja na stakalce na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, kap seruma u razrjeđenju 1:10 - 1:20 i kontrolna kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se odvojeno na staklo pomoću Pasteurove pipete. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obe bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir za nekoliko minuta vizuelno, ponekad i sa lupom (x5). Kod pozitivnog RA u kapi sa serumom uočava se pojava velikih i malih ljuskica, kod negativnog RA serum ostaje ravnomjerno zamućen.

REAKCIJA INDIREKTNE (PASIVNE) HEMAGLUTINACIJE (RNHA, RPHA)

Reakcija se postavlja: 1) da detektuje polisaharide, proteine, ekstrakte bakterija i drugih visoko dispergovanih supstanci, rikecija i virusa, čiji se kompleksi sa aglutininima ne mogu videti kod konvencionalnog RA, ili 2) da detektuju antitela u serumu pacijenata na ove visoko dispergovane supstance i najmanji mikroorganizmi.

Pod indirektnom, ili pasivnom, aglutinacijom se podrazumijeva reakcija u kojoj antitijela stupaju u interakciju s antigenima koji su prethodno adsorbirani na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barij oksid itd. ili eritrociti ovna, I (0) - ljudske krvne grupe).

U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA), eritrociti se koriste kao nosač. Antigenom napunjeni eritrociti se drže zajedno u prisustvu specifičnih antitela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPHA kao dijagnostikum eritrocita za detekciju antitijela (serodijagnostika). Ako su eritrociti napunjeni antitijelima (dijagnostikum eritrocitnih antitijela), onda se može koristiti za otkrivanje antigena.

Inscenacija. U jamicama polistirenskih tableta pripremite seriju serijskih razrjeđenja seruma. U pretposljednju rupicu unesite - 0,5 ml poznatog pozitivnog seruma iu posljednju 0,5 ml fiziološkog rastvora (kontrole). Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razblaženog eritrocitnog dijagnostikuma, promućka i stavi u termostat na 2 sata.

Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, eritrociti se talože na dnu jažice u obliku ravnog sloja ćelija sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom slučaju se talože u obliku dugmeta ili prstena. .

1.2. REAKCIJA NEUTRALIZACIJE. LIZA,
OPSON-FAGOCITNA REAKCIJA, REAKCIJA PREOSJETLJIVOSTI

REAKCIJA NEUTRALIZACIJE EGZOTOKSINA SA ANTITOKSINOM (RN)

Reakcija se temelji na sposobnosti antitoksičnog seruma da neutralizira djelovanje egzotoksina. Koristi se za titraciju antitoksičnih seruma i određivanje egzotoksina.

Kada se serum titrira, određena doza odgovarajućeg toksina se dodaje različitim razrjeđenjima antitoksičnog seruma. Uz potpunu neutralizaciju antigena i odsustvo neiskorištenih antitijela, dolazi do početne flokulacije. Reakcija flokulacije može se koristiti ne samo za titraciju seruma (na primjer, kod difterije), već i za titraciju toksina i toksoida. Reakcija neutralizacije toksina antitoksinom je od velike praktične važnosti kao metoda za određivanje aktivnosti antitoksičnih terapijskih seruma. Antigen u ovoj reakciji je pravi egzotoksin.

Jačina antitoksičnog seruma određena je konvencionalnim jedinicama AE.

1 AU botulinum seruma je količina koja neutralizira 1000 DLM botulinum toksina. Reakcija neutralizacije radi utvrđivanja vrste ili vrste egzotoksina (u dijagnostici tetanusa, botulizma, difterije itd.) može se provesti in vitro (prema Ramonu), a kod određivanja toksičnosti mikrobnih stanica - u gelu ( prema Ouchterlonyju).

Reakcija lize (RL)

Jedno od zaštitnih svojstava imunološkog seruma je njegova sposobnost da otapa mikrobe ili ćelijske elemente koji ulaze u tijelo.

Specifična antitijela koja uzrokuju otapanje (lizu) stanica nazivaju se lizini. Ovisno o prirodi antigena, mogu biti bakteriolizini, citolizini, spirohetolizini, hemolizini itd.

Lizini pokazuju svoj učinak samo u prisustvu dodatnog faktora - komplementa. Komplement se, kao faktor nespecifičnog humoralnog imuniteta, nalazi u gotovo svim tjelesnim tečnostima, osim u likvoru i tečnosti prednje očne komore. Prilično visok i konstantan sadržaj komplementa zabilježen je u ljudskom krvnom serumu i dosta toga u krvnom serumu zamorca. Kod ostalih sisara sadržaj komplementa u krvnom serumu je drugačiji.

Komplement je složen sistem proteina sirutke. Nestabilan je i kolabira na 55 stepeni 30 minuta. Na sobnoj temperaturi komplement se uništava u roku od dva sata. Vrlo je osjetljiv na dugotrajno mućkanje, na djelovanje kiselina i ultraljubičastih zraka. Međutim, komplement se čuva dugo (do šest mjeseci) u osušenom stanju na niskoj temperaturi. Komplement podstiče lizu mikrobnih ćelija i eritrocita.

Razlikovati reakciju bakteriolize i hemolize.

Suština reakcije bakteriolize je da kada se specifični imuni serum kombinuje sa odgovarajućim homolognim živim mikrobnim ćelijama u prisustvu komplementa, mikrobi se liziraju.

Reakcija hemolize se sastoji u tome što kada su eritrociti izloženi specifičnom, imunom na njih serumu (hemolitičkom) u prisustvu komplementa, eritrociti se rastvaraju, tj. hemoliza.

Reakcija hemolize u laboratorijskoj praksi koristi se za određivanje tyr komplementa, kao i za uzimanje u obzir rezultata dijagnostičkih testova fiksacije komplementa. Titar komplementa je najmanja količina koja uzrokuje lizu crvenih krvnih zrnaca u roku od 30 minuta u hemolitičkom sistemu u zapremini od 2,5 ml. Reakcija lize, kao i sve serološke reakcije, nastaje u prisustvu elektrolita.

REAKCIJE PREOSJETLJIVOSTI (ALERGIJSKE) REAKCIJE

Određeni oblici antigena, pri ponovljenom kontaktu s tijelom, mogu izazvati reakciju specifične prirode, ali uključuje nespecifične ćelijske i molekularne faktore akutnog upalnog odgovora. Poznata su dva oblika hiperreaktivnosti: preosjetljivost neposrednog tipa (ITH) i hipersenzitivnost odgođenog tipa (DTH). Prva vrsta reakcije se manifestuje uz učešće antitijela, dok se reakcija razvija najkasnije 2 sata nakon ponovnog kontakta s alergenom. Drugi tip se ostvaruje uz pomoć T-ćelija upale (Trzt) kao glavnih efektora reakcije, osiguravajući nakupljanje makrofaga u području upale, reakcija se manifestira nakon 6-8 sati i kasnije.

Nastanku reakcije preosjetljivosti prethodi susret sa antigenom i pojava senzibilizacije, tj. pojava antitijela, aktivno senzibiliziranih limfocita i pasivno senzibiliziranih citofilnim antitijelima drugih leukocita (makrofaga, granulocita).

Reakcije preosjetljivosti imaju tri faze razvoja: imunološku; patohemijski; patofiziološki.

U prvoj, specifičnoj fazi, alergen stupa u interakciju s antitijelima i (ili) senzibiliziranim stanicama. U drugoj fazi se iz aktiviranih ćelija oslobađaju biološki aktivne supstance. Oslobođeni medijatori (histamin, serotonin, leukotrieni, bradikinin itd.) izazivaju različite periferne efekte karakteristične za odgovarajući tip reakcije – treću fazu.

Reakcije preosjetljivosti četvrtog tipa

Reakcije ovog tipa uzrokovane su patogenim intercelularnim interakcijama senzibiliziranih T-pomagača, citotoksičnih T-limfocita (T-killera) i aktiviranih ćelija mononuklearnog fagocitnog sistema uzrokovane produženom stimulacijom imunog sistema bakterijskim antigenima, u kojima postoji relativna insuficijencija imunološkog sistema organizma da eliminiše bakterijske patogene iz unutrašnje sredine.zarazne bolesti. Ove reakcije preosjetljivosti uzrokuju tuberkulozne plućne šupljine, njihovu kazeoznu nekrozu i opću intoksikaciju kod bolesnika s tuberkulozom. Kožna granulomatoza kod tuberkuloze i lepre u morfopatogenetskom smislu se najvećim delom sastoji od reakcija preosetljivosti četvrtog tipa.

Najpoznatiji primjer reakcije preosjetljivosti tipa 4 je Mantouxova reakcija, koja se razvija na mjestu intradermalne primjene tuberkulina pacijentu čije su tijelo i sistem osjetljivi na mikobakterijske antigene. Kao rezultat reakcije formira se gusta hiperemična papula s nekrozom u centru, koja se pojavljuje samo nekoliko sati kasnije (polako) nakon intradermalne primjene tuberkulina. Formiranje papule počinje izlaskom iz vaskularnog kreveta u međustanične prostore mononuklearnih fagocita cirkulirajuće krvi. Istovremeno počinje emigracija iz vaskularnog korita polimorfonuklearnih ćelija. Zatim se infiltracija neutrofila smanjuje, a infiltrat počinje da se sastoji pretežno od limfocita i mononuklearnih fagocita. To je razlika između Mantouxove i Arthusove reakcije, u kojoj se pretežno polimorfonuklearni leukociti akumuliraju na mjestu lezije.

U reakcijama preosjetljivosti četvrtog tipa, dugotrajna stimulacija senzibiliziranih limfocita antigenima dovodi do patološki intenzivnog i produženog oslobađanja citokina od strane T-helpera na mjestima patoloških promjena u tkivima. Intenzivno oslobađanje citokina u lokusima oštećenja tkiva uzrokuje hiperaktivaciju ćelija sistema mononuklearnih fagocita koji se tamo nalaze, od kojih mnogi formiraju niti epiteloidnih ćelija u hiperaktiviranom stanju, a neki se međusobno spajaju u gigantske ćelije. Makrofagi, na čijoj su površini izloženi bakterijski i virusni antigeni, mogu se uništiti djelovanjem T-ubica (prirodnih ubica).

Reakcija preosjetljivosti tipa 4 je izazvana prepoznavanjem stranog bakterijskog antigena od strane T pomagača koji su senzibilizirani na njega. Neophodan uslov za prepoznavanje je interakcija induktora sa antigenima izloženim na površini antigen-prezentujućih ćelija nakon endocitoze i obrade stranih imunogena mononuklearnim fagocitima. Drugi neophodan uslov je izlaganje antigenima u kombinaciji sa molekulima klase I iz glavnog kompleksa kompatibilnosti tkiva. Nakon prepoznavanja antigena, senzibilizirani pomagači oslobađaju citokine i, posebno, interleukin-2, koji aktivira prirodne ubice i mononuklearne fagocite. Aktivirani mononuklearni fagociti oslobađaju proteolitičke enzime i slobodne kisikove radikale koji oštećuju tkiva.

Kožno-alergijski testovi - testovi za utvrđivanje senzibilizacije tijela na alergene, za određivanje njegove infekcije, na primjer, tuberkuloze, bruceloze, nivoa imuniteta stada, na primjer, na tularemiju. Prema mestu unošenja alergena razlikuju se: 1) kožni testovi; 2) skarifikaciju; 3) intradermalno; 4) potkožni. Klinička reakcija na alergen u kožno-alergijskom testu dijeli se na lokalnu, opću i žarišnu, kao i trenutnu i odgođenu.

Lokalne reakcije medijatorskog tipa HIT javljaju se nakon 5-20 minuta, izražene su u obliku eritema i zrna, nestaju nakon nekoliko sati, procjenjuju se plus metodom po količini eritema, mjerene u mm. Lokalne reakcije DTH-a nastaju nakon 24-48 sati, traju dugo, javljaju se kao infiltrat, ponekad sa nekrozom u centru, a procjenjuju se po veličini infiltrata u mm, također po plus sistemu. Kod citotoksičnih i imunokompleksnih tipova HIT-a, hiperemija i infiltracija se uočavaju nakon 3-4 sata, dostižu maksimum za 6-8 sati i nestaju nakon otprilike jednog dana. Ponekad se uočavaju kombinovane reakcije.

1.3. REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (CFR)

Ova reakcija se koristi u laboratorijskim studijama za otkrivanje antitijela u krvnom serumu za različite infekcije, kao i za identifikaciju patogena po antigenskoj strukturi.

Test fiksacije komplementa je složen serološki test i karakteriše ga visoka osjetljivost i specifičnost.

Karakteristika ove reakcije je da se promjena antigena tokom njegove interakcije sa specifičnim antitijelima događa samo u prisustvu komplementa. Komplement se adsorbuje samo na kompleksu antitelo-antigen. Kompleks antitijelo-antigen nastaje samo ako postoji afinitet između antigena i antitijela prisutnog u serumu.

Adsorpcija komplementa na kompleksu "antigen-antitijelo" može utjecati na sudbinu antigena na različite načine, ovisno o njegovim karakteristikama.

Neki od antigena pod ovim uslovima prolaze kroz oštre morfološke promene, sve do rastvaranja (hemoliza, Isaev-Pfeiferov fenomen, citolitičko delovanje). Drugi mijenjaju brzinu kretanja (imobilizacija treponema). Drugi umiru bez drastičnih destruktivnih promjena (baktericidno ili citotoksično djelovanje). Konačno, adsorpcija komplementa možda neće biti praćena promjenama u antigenu koje su lako uočljive.

Prema mehanizmu, RSC se odvija u dvije faze:

1. Prva faza je formiranje kompleksa antigen-antitijelo i adsorpcija na ovom kompleksu komplementa. Rezultat faze nije vizuelno vidljiv (interakcija antigena i antitela uz obavezno učešće komplementa).
2. Druga faza je promena antigena pod uticajem specifičnih antitela u prisustvu komplementa. Rezultat faze može biti vizuelno vidljiv ili ne vidljiv (detekcija rezultata reakcije pomoću indikatorskog hemolitičkog sistema (ovčiji eritrociti i hemolitički serum).

Do uništenja eritrocita hemolitičkim serumom dolazi samo u slučaju vezivanja komplementa za hemolitički sistem. Ako je komplement ranije adsorbiran na kompleksu antigen-antitijelo, tada ne dolazi do hemolize eritrocita.

Rezultat eksperimenta se procjenjuje primjenom prisustva ili odsustva hemolize u svim epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom s potpunim kašnjenjem hemolize, kada je tekućina u epruveti bezbojna i eritrociti se talože na dno, negativnom - s potpunom lizom eritrocita, kada je tekućina intenzivno obojena ("lakirana" krv). Stepen kašnjenja hemolize se procjenjuje u zavisnosti od intenziteta boje tekućine i količine sedimenta eritrocita na dnu (++++, +++, ++, +).

U slučaju kada promjene u antigenu ostaju nedostupne za vizualno promatranje, potrebno je koristiti drugi sistem koji djeluje kao indikator koji vam omogućava da procijenite stanje komplementa i izvučete zaključak o rezultatu reakcije.

Ovaj indikatorski sistem predstavljaju komponente reakcije hemolize, koje uključuju ovčje eritrocite i hemolitički serum koji sadrži specifična antitijela na eritrocite (hemolizine), ali ne sadrži komplement. Ovaj sistem indikatora se dodaje u epruvete jedan sat nakon postavljanja glavnog CSC-a. Ako je reakcija fiksacije komplementa pozitivna, tada se formira kompleks antitijelo-antigen koji adsorbira komplement na sebe. Pošto se komplement koristi u količini potrebnoj za samo jednu reakciju, a do lize eritrocita može doći samo u prisustvu komplementa, onda kada se on adsorbuje na kompleks antigen-antitelo, neće doći do lize eritrocita u hemolitičkom (indikatorskom) sistemu. Ako je reakcija fiksacije komplementa negativna, kompleks antigen-antitelo se ne formira, komplement ostaje slobodan, a kada se doda hemolitički sistem dolazi do lize eritrocita.

1.4. DNK SONDE. POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA (PCR),
IMUNO-ENZIMSKA METODA (ELISA), METODA FLUORESCIRANJA ANTITELA (MFA)

METODE ISPITIVANJA GENOM

Intenzivan razvoj molekularne biologije i stvaranje savršene metodološke osnove za genetička istraživanja postali su osnova genetskog inženjeringa. U oblasti dijagnostike nastao je i ubrzano se razvija pravac za određivanje specifičnih nukleotidnih sekvenci DNK i RNK, takozvano gensko sondiranje. Takve metode se zasnivaju na sposobnosti nukleinskih kiselina da se hibridiziraju, odnosno da formiraju dvolančane strukture zbog interakcije komplementarnih nukleotida (A–T, G–C).

Da bi se odredila željena sekvenca DNK (ili RNK), posebno se kreira takozvana polinukleotidna sonda sa specifičnom baznom sekvencom. U njegov sastav uvedena je posebna oznaka koja omogućava identifikaciju formiranja kompleksa.

Iako se gensko sondiranje ne može pripisati metodama imunohemijske analize, njegov glavni princip (interakcija komplementarnih struktura) se metodički provodi na isti način kao indikatorske metode imunodijagnostike. Osim toga, metode genskog sondiranja omogućavaju popunjavanje informacija o infektivnom agensu u odsustvu njegove fenotipske ekspresije (virusi ugrađeni u genom, "tihi" geni).

Za analizu DNK, uzorak se podvrgava denaturaciji kako bi se dobile jednolančane strukture s kojima reagiraju molekuli DNK ili RNK sonde. Za pripremu sondi koriste se ili različiti regioni DNK (ili RNK) izolovani iz prirodnog izvora (na primer, jednog ili drugog mikroorganizma), koji se obično predstavljaju kao genetske sekvence kao deo vektorskih plazmida, ili hemijski sintetizovani oligonukleotidi. U nekim slučajevima se kao sonda koriste preparati genomske DNK hidrolizovane u fragmente, ponekad preparati RNK, posebno često ribosomska RNK. Kao oznaka koriste se isti indikatori kao i u raznim vrstama imunohemijskih analiza: radioaktivni izotopi, fluoresceini, biotop (sa daljom manifestacijom kompleksom avidin-enzim) itd.

Redoslijed analize određen je svojstvima dostupne sonde

Trenutno se sve više koriste komercijalni setovi koji sadrže sve potrebne sastojke.

U većini slučajeva, postupak analize može se podijeliti u sljedeće faze: priprema uzorka (uključujući ekstrakciju i denaturaciju DNK), fiksiranje uzorka na podlogu (najčešće filter od polimerne membrane), predhibridizacija, sama hibridizacija, ispiranje nevezanih proizvoda, detekcija. U nedostatku standardne pripreme DNK ili RNK sonde, prvo se dobije i označi.

Za pripremu uzorka, možda će biti potrebno "uzgojiti" ispitni materijal kako bi se identificirale pojedinačne kolonije bakterija ili povećala koncentracija virusa u ćelijskoj kulturi. Također se provodi direktna analiza uzoraka krvnog seruma, urina, krvnih stanica ili pune krvi na prisustvo infektivnog agensa. Da bi se nukleinske kiseline oslobodile iz sastava ćelijskih struktura, ćelije se liziraju, au nekim slučajevima preparat DNK se pročišćava fenolom.

Denaturacija DNK, odnosno njen prelazak u jednolančani oblik, dešava se tokom tretmana alkalijom. Uzorak nukleinske kiseline se zatim fiksira na nitrocelulozni ili najlonski membranski nosač, obično inkubacijom od 10 minuta do 4 sata na 80°C pod vakuumom. Nadalje, u procesu prehibridizacije, postiže se inaktivacija slobodnih veznih mjesta kako bi se smanjila nespecifična interakcija sonde sa membranom. Proces hibridizacije traje od 2 do 20 sati, ovisno o koncentraciji DNK u uzorku, koncentraciji korištene sonde i njenoj veličini.

Nakon što se hibridizacija završi i nevezani proizvodi se isperu, detektuje se nastali kompleks. Ako sonda sadrži radioaktivnu oznaku, tada se membrana izlaže fotografskom filmu kako bi se manifestirala reakcija (autoradiografija). Za druge oznake koristite odgovarajuće postupke.

Najperspektivnija je proizvodnja neradioaktivnih (tzv. hladnih) sondi. Na istoj osnovi razvija se tehnika hibridizacije koja omogućava utvrđivanje prisustva patogena u preparatima rezova, punkcijama tkiva, što je posebno važno u patomorfološkoj analizi (in situ hibridizacija).

Bitan korak u razvoju metoda genskog sondiranja bila je upotreba reakcije amplifikacije polimeraze (PCR). Ovaj pristup omogućava povećanje koncentracije specifične (prethodno poznate) sekvence DNK u uzorku sintetiziranjem više kopija in vitro. Da bi se izvela reakcija, uzorku DNK koji se proučava dodaje se preparat enzima DNK polimeraze, višak deoksinukleotida za sintezu i takozvani prajmeri. Jedan od prajmera treba da bude kopija početka regiona čitanja kodirajućeg lanca DNK u smeru čitanja 5–3, a drugi treba da bude kopija suprotnog kraja nekodirajućeg lanca. Zatim, sa svakim ciklusom reakcije polimeraze, broj kopija DNK se udvostručuje.

Vezivanje prajmera zahteva denaturaciju DNK (tapanje) na 94°C, nakon čega sledi dovođenje smeše na 40-55°C.

Za izvođenje reakcije dizajnirani su programibilni inkubatori za mikrouzorke da lako mijenjaju temperaturne promjene koje su optimalne za svaku fazu reakcije.

Reakcija amplifikacije može značajno povećati osjetljivost analize tokom sondiranja gena, što je posebno važno pri niskim koncentracijama infektivnog agensa.

Jedna od značajnih prednosti sondiranja gena sa amplifikacijom je mogućnost proučavanja submikroskopske količine patološkog materijala.

Još jedna karakteristika metode, važnija za analizu infektivnog materijala, je mogućnost otkrivanja skrivenih (tihih) gena. Metode povezane sa upotrebom genskog sondiranja sigurno će se sve više uvoditi u praksu dijagnosticiranja zaraznih bolesti kako budu sve jednostavnije i jeftinije.

ELISA i RIF metode su uglavnom kvalitativne ili polukvantitativne. Pri vrlo niskim koncentracijama komponenti formiranje kompleksa antigen-antitijelo ne može se registrirati ni vizualno ni jednostavnim instrumentima. Indikacija kompleksa antigen-antitijelo u takvim slučajevima može se provesti ako je jedna od početnih komponenti - antigen ili antitijelo - označena, što se može lako detektirati u koncentracijama usporedivim s koncentracijom analita koji se određuje.

Radioaktivni izotopi (na primjer, 125I), fluorescentne tvari i enzimi mogu se koristiti kao oznaka.

U zavisnosti od oznake koja se koristi, razlikuju se radioimune (RIA), fluorescentne imunološke (FIA), enzimske imunoesejske (ELISA) metode analize itd. Poslednjih godina ELISA je dobila široku praktičnu primenu, koja je povezana sa mogućnošću kvantitativnog određivanja. , visoka osjetljivost, specifičnost i automatizacija računovodstva.

ELISA metode analize - grupa metoda koje omogućavaju detekciju kompleksa antigen-antitijelo korištenjem supstrata koji se cijepa enzimom sa pojavom boje.

Suština metode je u kombinaciji komponenti reakcije antigen-antitijelo sa izmjerenom oznakom enzima. Antigen ili antitijelo koje reaguje označeno je enzimom. Po transformaciji supstrata pod dejstvom enzima može se suditi o količini komponente reakcije antigen-antitelo koja je ušla u interakciju. Enzim u ovom slučaju služi kao marker imunološkog odgovora i omogućava vam da ga promatrate vizualno ili instrumentalno.

Enzimi su vrlo zgodne oznake jer im njihova katalitička svojstva omogućavaju da djeluju kao pojačivači, budući da jedna molekula enzima može proizvesti više od 1 x 105 molekula katalitičkog proizvoda u minuti. Neophodno je odabrati enzim koji dugo zadržava svoju katalitičku aktivnost, ne gubi je kada se veže za antigen ili antitijelo i ima visoku specifičnost u odnosu na supstrat.

Glavne metode za dobijanje antitela ili antigena obeleženih enzimom - konjugati: hemijski, imunološki i genetski inženjering. Za ELISA se najčešće koriste enzimi: peroksidaza hrena, alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.

Za otkrivanje aktivnosti enzima u kompleksu antigen–antitijelo u svrhu vizualne i instrumentalne registracije reakcije koriste se hromogeni supstrati čiji rastvori, u početku bezbojni, dobijaju boju tokom enzimske reakcije čiji intenzitet je proporcionalna količini enzima. Dakle, za otkrivanje aktivnosti peroksidaze hrena u čvrstoj fazi ELISA, kao supstrat se koristi 5-aminosalicilna kiselina koja daje intenzivnu smeđu mrlju, orto-fenilendiamin, koja formira narandžasto-žutu mrlju. Za otkrivanje aktivnosti alkalne fosfataze i β-galatozidaze koriste se nitrofenilfosfati i nitrofenilgalaktozidi.

Rezultat reakcije u formiranju obojenog proizvoda određuje se vizualno ili pomoću spektrofotometra koji mjeri apsorpciju svjetlosti određene valne dužine.

Postoji mnogo opcija za postavljanje ELISA testa. Postoje homogene i heterogene varijante.

Prema načinu postavljanja razlikuju se kompetitivne i nekonkurentne ELISA metode. Ako je u prvoj fazi samo analizirano jedinjenje i njegovi odgovarajući centri za vezivanje (antigen i specifična antitela) prisutni u sistemu, onda je metoda nekonkurentna. Ako su analizirano jedinjenje (antigen) i njegov analog (antigen obeležen enzimom) prisutni u prvoj fazi, koji se međusobno nadmeću za vezivanje za specifična mesta vezivanja (antitela) koja nedostaju, tada je metoda konkurentna. U ovom slučaju, što više test antigena sadrži rastvor, to je manja količina vezanih obeleženih antigena.

FLUORESCENTNA METODA ANTITIJELA (MFA) ili IMUNOLUORESCENTNE REAKCIJE (RIF)

Imunofluorescentna metoda je metoda izbora za brzo otkrivanje i identifikaciju nepoznatog mikroorganizma u ispitivanom materijalu.

Ag + AT + elektrolit = UV-svetleći kompleks

Mikrobni serum označen fluorohromom

Često se koristi boja fluorescein izotiocijanat - FITC

U ovoj studiji koristi se fluorescentni mikroskop.

RIF inscenacija

30 µl otopine FITC-obilježenih antitijela nanese se na bris.

Staklo se stavlja u vlažnu komoru i drži na sobnoj temperaturi 20-25 minuta, ili u termostatu na 37°C 15 minuta.

Ispirite čašu tekućom vodom iz slavine 2 min, isperite destilovanom vodom i osušite na vazduhu.

Kap tečnosti za montažu nanosi se na osušeni razmaz, razmaz se prekriva zaštitnim staklom i mikroskopira pomoću fluorescentnog mikroskopa ili fluorescentnog nastavka na konvencionalni optički mikroskop.

Reakcija aglutinacije temelji se na specifičnoj interakciji antitijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama. Kao rezultat ove interakcije nastaju čestice-aglomerati koji se talože (aglutiniraju). U reakciji aglutinacije mogu sudjelovati bakterije, protozoe, gljive, kvasci, rikecije, eritrociti i druge ćelije, kako žive tako i ubijene. Reakcija se odvija u dvije faze: prva je specifična kombinacija antigena i antitijela, druga je nespecifična, odnosno stvaranje vidljivog aglutinata. Taloženje aglutinata nastaje u prisustvu elektrolita, kao što je natrijum hlorid. Mikroorganizmi u aglutinatu ostaju živi, ​​ali gube pokretljivost.

Reakcija aglutinacije se široko koristi za serološku dijagnostiku zaraznih bolesti i određivanje antigenske strukture izolovanih mikroba. Za utvrđivanje antigenske strukture patogena izoliranog iz tijela pacijenta ili nosioca koristi se specifični imunološki serum dobiven imunizacijom životinja (zec, magarac, ovan) određenim mikroorganizmima. Identifikacija mikroba se vrši u reakciji aglutinacije na staklu sa adsorbovanim ili monoreceptorskim serumima ili u epruvetama sa specifičnim aglutinirajućim serumima. Adsorbirani serumi sadrže antitijela samo na antigene specifične za dati mikrob, a monoreceptorski serumi sadrže antitijela samo na jedan specifični antigen patogena.

Serumi vrste sadrže antitijela na sve antigene određenog mikroba.

Pripadnost izolovane kulture mikroorganizma ovoj vrsti utvrđuje se aglutinacijom sa poznatim serumom do titra antitijela naznačenog na etiketi ampule seruma. Smatra se da je titar serumskih antitijela njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se još uvijek opaža aglutinacija kulture mikroba korištenih za imunizaciju životinje. Adsorbirani i monoreceptorski serumi se obično koriste nerazrijeđeni u reakciji aglutinacije na staklu.

Prilikom određivanja prisutnosti antitijela u krvnom serumu pacijenta, razrjeđuje se izotoničnom otopinom natrijevog klorida, počevši od razrjeđenja od 1:50 do 1:800 ili više. Svakom razrjeđivanju dodaje se suspenzija živih ili ubijenih mikroba. Preparati koji sadrže mikrobe ubijene toplotom ili formalinom nazivaju se dijagnostikumi. Dijagnostikumi dobiveni zagrijavanjem kultura mikroorganizama sadrže samo somatske antigene. Kada se koristi samo formalin, flagelarni antigeni se takođe čuvaju u mikrobima.

U prisustvu antitijela u krvi pacijenta, dijagnostikum uzet u reakciji se lijepi i talog (aglutinat) se formira u dvije epruvete. U ovom slučaju, rezultati reakcije aglutinacije smatraju se pozitivnim. U kontrolnoj epruveti, u koju se dodaju izotonični rastvor natrijum hlorida i dijagnostikum, suspenzija mikroba treba da bude homogena (negativna reakcija aglutinacije).

Obračun rezultata reakcije aglutinacije kod nekih bolesti, kao što je leptospiroza, provodi se samo mikroskopski u tamnom vidnom polju mikroskopa (mikroaglutinacija). Za postavljanje serološke dijagnoze bolesti uzima se u obzir dijagnostička bolest. Obično odgovara razrjeđenju seruma od 1:100 ili 1:200.

Antitijela u krvnom serumu bolesnika pomoću reakcije aglutinacije mogu se otkriti u slučajevima trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija), tularemije itd.
Kastelanijeva reakcija. Kod nekih zaraznih bolesti ili imunizacije mikroorganizmima koji u svom sastavu imaju grupne antigene, pored specifičnih antitela za ovu vrstu, u krvnom serumu se pojavljuju i grupna antitela. U ovom slučaju, srodne bakterijske vrste će biti aglutinirane nastalim serumima.

Castellani je predložio metodu za adsorpciju grupnih antitijela iz imunih seruma, zasnovanu na njihovom uklanjanju uz pomoć mikroorganizama srodnih vrsta koje imaju grupne antigene, ali nemaju specifične. Kultura takvih mikroorganizama, dodana u serum, adsorbira antitijela nespecifične grupe, a nakon uklanjanja kompleksa antigen-antitijelo centrifugiranjem, u serumu ostaju samo specifični imunoglobulini. Serumi tretirani po Castellani metodi mogu se koristiti u reakciji aglutinacije kao visoko specifični.

Cilj: Ovladati tehnikom insceniranja reakcije aglutinacije i precipitacijske reakcije za dijagnostiku zaraznih bolesti.

Modul 1 Morfologija i fiziologija mikroorganizama. Infekcija. Imunitet.

Tema 16: Reakcija aglutinacije. reakcija precipitacije.

Relevantnost teme. Ispod imunitet podrazumijevaju imunitet organizma na infektivne i neinfektivne agense (patogene mikroorganizme, strane proteine ​​i druge tvari). Ovi agensi se nazivaju antigeni. Imunitet je ili urođen ili stečen. Kongenitalno- kada se formiraju tkivni i humoralni zaštitni uređaji koji izazivaju imunitet na zarazne bolesti koje su naslijeđene.

Stečeno- provodi ga imunološki sistem organizma u obliku proizvodnje antitijela ili nakupljanja senzibiliziranih limfocita. Podijeljen je na prirodni i veštački. Prema mehanizmu djelovanja dijeli se na aktivni i pasivni. U svim imunološkim reakcijama glavna komponenta je antigen.

Glavna funkcija imunog sistema, koji se sastoji od limfoidnog tkiva, je prepoznavanje stranih agenasa (antigena) i njihova neutralizacija.

Antigeni mogu ući u tijelo kroz respiratorni trakt, probavni trakt, preko kože i sluzokože. Svaki antigen stimulira stvaranje specifičnih proteinskih supstanci - antitijela.

Antigeni dijele se na potpune i inferiorne (haptene). Kompletni antigeni izazvati potpuni imunološki odgovor. Defektni antigeni ne izazivaju samostalno imunološki odgovor, ali ponekad stiču ovu sposobnost kada su konjugirani s proteinskim nosačima visoke molekularne težine. Osim toga, postoje i antigeni: poluhapteni, proantigeni, heteroantigeni i izoantigeni.

Antitijela su humani ili životinjski serumski imunoglobulini. Antitijela nastaju nakon infekcije, a kao rezultat imunizacije oslabljenim ili ubijenim bakterijama, rikecijama, virusima, toksinima i drugim agensima. Antitijela- Imunoglobulinski proteini su hemijski klasifikovani kao glikoproteini. Prema strukturi i imunobiološkim svojstvima, imunoglobulini se dijele na 5 klasa: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normalna antitela nalazi se kod ljudi i životinja koje nisu imunizirane. Specifična antitela nastaju kao rezultat infekcije ili imunizacije.

Reakcija između antitijela i antigena naziva se serološki. Serološke reakcije su vrlo specifične i koriste se u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti. Postoje reakcije aglutinacije i precipitacije.

1. Reakcija aglutinacije (RA) zasniva se na interakciji antigena (aglutinogena) i antitijela (aglutinina), u kojoj dolazi do aglutinacije i taloženja mikrobnih tijela u prisustvu elektrolita. Postoje različite modifikacije formulacije reakcije aglutinacije.

Najvažnije su:

- Makroskopska (raspoređena) aglutinacija u epruvetama. Pacijentovom serumu se dodaje suspenzija mikroba (diagnosticum), a nakon 1 sata u termostatu na temperaturi od 37 stepeni, bilježi se razrjeđenje (titar) seruma pri kojem je došlo do reakcije. Reakcija aglutinacije se smatra pozitivnom kada se na dnu epruvete formira precipitat uz izraženo bistrenje supernatanta. Ovaj talog se naziva aglutinat.

Prema prirodi aglutinata razlikuju se finozrnasta (O) i krupnozrna (H) aglutinacija. Za otkrivanje sitnozrnastog aglutinata koristi se aglutinoskop. Obračun rezultata počinje s kontrolnim epruvetama. Posljednje razrjeđenje seruma u kojem je uočena aglutinacija smatra se njegovim titrom.

Svrha reakcije: otkrivanje antitijela u serumu pacijenta.

- mikroskopski (ubrzani) ) približna aglutinacija na staklu. Kap bakterijske kulture dodaje se kapi dijagnostičkog imunološkog seruma i ravnomjerno se miješa. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi nakon 5-10 minuta. Zatim se pravi račun. Uz pozitivnu reakciju u kapi seruma, primjećuje se nakupljanje bakterija u obliku zrnaca ili pahuljica. Svrha reakcije: utvrditi vrstu patogena prema poznatom dijagnostičkom serumu.

- Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (RNGA). Suština ove reakcije leži u činjenici da su eritrociti ovna sposobni adsorbirati antigene na svojoj površini. Pod uticajem specifičnih antitela, eritrociti se lepe i talože, formirajući na dnu hemaglutinat. Reakcija je vrlo osjetljiva i specifična. RNGA vam omogućava da otkrijete minimalnu količinu antitijela i defektnih antigena polisaharidne prirode. Ova reakcija se koristi u dijagnostici mnogih zaraznih bolesti (tifus i tifus, paratifus, tuberkuloza itd.).

2. Reakcija precipitacije (RP ) – precipitacija kompleksa antigen-antitijelo. Glavna razlika između RP i RA je u tome što se kod RA koristi korpuskularni antigen, dok je u RP antigen koloidna supstanca proteinske ili polisaharidne prirode. U ovoj reakciji, antigen se naziva precipitogen, a antitijela se nazivaju precipitini. Reakcija se stavlja u epruvete nanošenjem rastvora antigena na imuni serum. Sa optimalnim omjerom antigena i antitijela na granici

ovi rastvori formiraju taložni prsten. Ako se kao antigen koriste prokuvani i filtrirani ekstrakti organa i tkiva, reakcija se naziva reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija, koja se koristi u dijagnostici antraksa, kuge, tularemije itd.).

Reakcije taloženja u agaru se široko koriste: metoda jednostavne difuzije, metoda dvostruke difuzije.

Vrsta padavina je reakcija flokulacije- za određivanje aktivnosti toksoida ili antitoksičnog seruma. Osim toga, ova reakcija se može koristiti za određivanje toksičnosti sojeva Corynebacterium diphtheriae.

Specifični ciljevi:

· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunog odgovora;

· Opisati strukturu antigena, uključujući antigene mikroorganizama;

· Opisati mehanizam reakcije aglutinacije;

· Opisati mehanizam reakcije taloženja.

biti u mogućnosti da:

· Objasniti ulogu antigena kao induktora imunog odgovora;

Opisati strukturu antitijela (različite klase imunoglobulina);

· Analizirati mehanizam interakcije antitela sa antigenima;

· Interpretirati rezultate reakcije aglutinacije;

· Interpretirati rezultate reakcije taloženja;

· Analizirati rezultate.

Teorijska pitanja:

1. Definicija pojma "antigeni", "antitijela".

2. Uloga antigena kao induktora imunog odgovora.

3. Struktura antitela (različite klase imunoglobulina).

4. Mehanizam interakcije antitela sa antigenima.

5. Reakcije imunog sistema, njihova uloga u imunološkom odgovoru i dijagnostici zaraznih bolesti.

6. Mehanizam reakcije aglutinacije.

7. Mehanizam reakcije taloženja.

Praktični zadaci koji se izvode u učionici:

1. Postavljanje reakcije aglutinacije za otkrivanje antitijela u serumu pacijenta.

2. Postavljanje reakcije mikroaglutinacije na staklu sa dijagnostičkim serumima za identifikaciju čiste bakterijske kulture.

3. Procjena rezultata reakcije aglutinacije.

4. Postavljanje precipitacijske reakcije za otkrivanje bakterijskog antigena.

5. Procjena rezultata reakcije taloženja.

6. Procjena rezultata reakcije indirektne hemaglutinacije.

7. Registracija protokola.

književnost:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologija sa virusologijom i imunologijom - Kijev: Viša škola, 1992.- 431 str.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologija.- M.: Medicina, 1998.- 336s.

3. Medicinska mikrobiologija /Uredio V.P. Pokrovsky - M.: GEOTAR-MED, 2001. - 768s.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, imunologija i virologija / Udžbenik za medicinske univerzitete, Sankt Peterburg: "Specijalna literatura", 1998.- 592 str.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologija / Udžbenik - 2. izd., revidirano. i dodaj - M.: Medicina, 1983.- 512s.

6. Bilješke s predavanja.

Dodatna literatura:

1. Titov M.V. Infektivne bolesti - K., 1995. - 321s.

2. Šuvalova E.P. Infektivne bolesti - M.: Medicina, 1990. - 559s.

Reakcija aglutinacije.

Reakcija aglutinacije je adhezija i taloženje mikrobnih ili drugih stanica (eritrocita) pod djelovanjem antitijela u prisustvu elektrolita. Vidljivi efekat reakcije (fenomen aglutinacije) je stvaranje taloga koji se naziva aglutinat.

Ova reakcija se koristi za serodijagnostika i seroididentifikacija. RA se koristi za serodijagnostiku (otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata) tifus i paratifus(Vidal reakcija), bruceloza(reakcija Wrighta), tularemija i leptospiroza. RA se koristi za seroidifikaciju (određivanje vrste patogena izolovanog od pacijenta) kada crijevne infekcije, veliki kašalj, kolera i sl.

Komponentereakcije:

1. A antigen (aglutinogen) - to su cijele (ne uništene) mikrobne ili druge ćelije ( korpuskularno, nerastvorljivi antigen). Aglutinogeni- to je suspenzija živ ili ubijen mikrobne ćelije ili bilo koje druge ćelije. Antigeni mogu biti nepoznati ili poznati. Nepoznati aglutinogen je mikrobna kultura izolirana iz tijela pacijenta koju treba odrediti. poznati antigen. diagnosticum- dijagnostički lijek - suspenzija mrtvih mikrobi poznate vrste u fiziološkom rastvoru. Ova suspenzija maglovito (providno)), jer mikrobne ćelije se ne rastvaraju, već ostaju netaknute. Poznati aglutinogen će se koristiti za otkrivanje nepoznatih antitijela u serumu pacijenta.

2. Antitijelo (aglutinin)- nalazi se u krvnom serumu. Antitijela također mogu biti nepoznata ili poznata. U krvnom serumu nalaze se nepoznata antitijela koja treba odrediti bolesna osoba. Poznata antitijela se nalaze u imunološki dijagnostički serumi, koji se zovu aglutinirajući serumi. Koriste se za seroidifikaciju, tj. za određivanje nepoznatog antigena – vrste mikrobne kulture.

3. Elektrolit- 0,9% rastvor natrijum hlorida.

Načini postavljanja RA.

1. Približni (ploča) RA- izvedeno na staklu. Nanesite 2 kapi seruma i 1 kap izotonične otopine na predmetno staklo. Mikrobna kultura se petljom unosi u jednu od kapi seruma i u kap izotonične otopine i miješa. Kap izotonične otopine sa klicama – kontrola antigena, kap serumi bez klica – kontrola antitela, kap serum sa mikrobima – iskustvo. Ako serum sadrži antitijela koja odgovaraju mikrobnim antigenima koji su pomiješani s njim, tada će se antitijela i antigeni specifično vezati jedni za druge i nakon 1-3 minute u eksperimentalnoj kapi će se pojaviti aglutinatne ljuspice. Kontrola antigena treba da bude mutna, a kontrola antitela bistra. Obračun rezultata reakcije vrši se pojavom pahuljica aglutinata . Ako pahuljice ispadnu, reakcija je pozitivna, tj. antigen odgovara antitelu, a antigen se može koristiti za identifikaciju antitela, ili obrnuto. Ako zamućenost ostane, reakcija je negativna.

2. Produžena reakcija aglutinacije - izvedeno u epruvetama. Prvo se pripremaju 2-struka razrjeđenja krvnog seruma bolesne osobe od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotoničnog rastvora natrijum hlorida se sipa u 6 epruveta. U prvu epruvetu doda se 1 ml pacijentovog krvnog seruma u razrjeđenju 1:50, pomiješa se i dobije se razrjeđenje 1:100, zatim se 1 ml razrijeđenog 1:100 prenese u drugu epruvetu. i dobije se razrjeđenje 1:200 itd. Ostavljene su dvije epruvete za kontrolu antigena i seruma. Kontroli seruma dodaje se samo serum razrijeđen 1:50, kontroli antigena se dodaje samo antigen. 0,1 ml antigena - diagnosticuma (O- ili H-) dodaje se u sve ostale epruvete i sve epruvete se stavljaju u termostat na 37°C 18-20 sati. Obračun rezultata reakcije vrši se prema prirodi, količini nastalog taloga (aglutinata) i stepenu zamućenosti. Obračun se vrši samo sa sljedećim rezultatima u kontrolama: kontrola seruma - providna, kontrola antigena - zamućena. O-antitijela daju fino zrnati precipitat. H-antitijela - krupno zrnasta. Prema posljednjoj epruveti, u kojoj je reakcija aglutinacije još vidljiva, postavljeno dijagnostički titar.

Prilikom serodijagnostike bolesti važno je ne samo otkriti specifična antitijela na određeni patogen, već i identificirati njihov broj, tj. ustanoviti takav titar antitijela kada možemo govoriti o prisutnosti bolesti uzrokovane ovim patogenom. Ovaj titar se naziva dijagnostički titar. Na primjer, za dijagnosticiranje trbušnog tifusa potrebno je otkriti titar antitijela 1:400, ali ne manji. Još precizniji rezultati se dobijaju detekcijom porasta antitela u parnim serumima.Serum pacijenta se uzima na početku bolesti i nakon 3-5 ili više dana. Ako se titar antitijela poveća za najmanje 4 puta, onda možemo govoriti o trenutnoj bolesti.

Reakcija aglutinacije (RA) je adhezija i precipitacija mikroba ili drugih ćelija pod dejstvom antitela u prisustvu elektrolita. Nastali precipitat naziva se aglutinat.

RA se koristi:

1. Otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta (serodijagnostika).

2. Odrediti vrstu i serovar čiste kulture patogenih mikroorganizama izolovanih od pacijenta (serotipizacija).

Reakcija aglutinacije se koristi za određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, kod trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (reakcije Wright, Huddleson), tularemije, leptospiroze i drugih zaraznih bolesti, kao i za određivanje patogen izoliran od pacijenta (crijevne infekcije, veliki kašalj, itd.). RA se koristi za određivanje krvnih grupa, Rh faktora itd.

Za reakciju su potrebne sljedeće komponente:

1. Antigen (aglutinogen) mora biti korpuskularan, odnosno, to je suspenzija živih ili ubijenih mikroorganizama (dijagnoza m), eritrocita ili drugih ćelija. Obično se koristi dnevna kultura mikroorganizama uzgajanih na kosom agaru. Kultura se ispere sa 3-4 ml izotonične otopine, prenese u sterilnu epruvetu i odredi se gustina. Suspenzija mora biti homogena i sadržavati do 3 milijarde mikrobnih ćelija po 1 ml. Upotreba suspenzije ubijenih mikroba - dijagnostikuma - olakšava rad (pripremljena u fabrici).

2. Antitijela (aglutinini) se nalaze u serumu pacijenta (sa serodijagnozom) ili u aglutinirajućem serumu (sa serotipizacijom). Aglutinirajući serumi se dobijaju imunizacijom zečeva ubijenim bakterijama.

Titar aglutinirajući serum se naziva njegovim najvećim razblaženjem, u kojem ne reaguje sa odgovarajućim antigenom pod određenim eksperimentalnim uslovima.

Aglutinirajući serumi mogu biti nativni (neadsorbirani) i adsorbirani. Nativni serumi u malim razrjeđenjima djeluju ne samo s vrstom mikroorganizama s kojima je životinja imunizirana da bi se dobio serum, već i sa srodnim vrstama mikroorganizama, budući da sadrže grupna antitijela (antitijela na mikroorganizme koji imaju zajedničke antigene). Nativni serumi se koriste za produženu reakciju aglutinacije (sa serodijagnostikom), koja uzima u obzir ne samo prisustvo reakcije, već i dinamiku povećanja titra antitijela.

Ako se grupna antitijela ekstrahiraju (adsorbiraju) iz nativnog seruma interakcijom sa srodnim bakterijama koje imaju grupne antigene, dobijaju se adsorbirani serumi. Adsorbirani serumi mogu biti monoreceptorski (ili tip-specifični), koji sadrže antitijela samo na jedan receptor antigena Polivalentni serumi se sastoje od mješavine nekoliko adsorbiranih ili neadsorbiranih seruma. Za reakciju aglutinacije na staklu koriste se adsorbirani serumi.

Kada se životinje imuniziraju pokretnim bakterijama s H-antigenom, dobivaju se H-aglutinirajući serumi koji sadrže H-antitijela (na primjer, H-aglutinirajući serum sa monoreceptorom Salmonella). Imunizacija O-antigenom proizvodi O-aglutinirajući serum koji sadrži O-antitijela (na primjer, O-aglutinirajući serum adsorbiran salmonelom, O-aglutinirajući serum protiv kolere). Imunizacija H- i O-antigenima proizvodi serume sa H- i O-antitijelima.

Štaviše, O-aglutinini daju sitnozrnati aglutinat, a H-aglutinini daju krupnozrnati talog.

3. Elektrolit - izotonični rastvor NaCl (0,9% rastvor natrijum hlorida pripremljen sa destilovanom vodom).

Postoje dvije glavne metode za uspostavljanje reakcije aglutinacije: reakcija na staklu (ponekad se naziva indikativna ili lamelarna) i proširena reakcija (u epruvetama)

Prikaz reakcije aglutinacije na staklu. Dvije kapi seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Dijagnostički aglutinirajući serum uzima se u jednom razrjeđivanju, koje, ovisno o njegovom titru, iznosi 1:10, 1:25, 1:50 ili 1:100. U jednu od kapi seruma i kap izotonične otopine, petljom se unosi kultura ispitivanog mikroorganizma i temeljito se miješa. Kap natrijum hlorida sa mikroorganizmima je kontrola antigena, kap seruma bez mikroorganizama je kontrola seruma. Nemojte prenositi kulturu iz kapi seruma u kap NaCl. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 min. Ako kontrola seruma ostane bistra, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje je kultura pomiješana sa serumom, tada se rezultat smatra pozitivnim. Ako je u kapi sa serumom i antigenom ujednačena zamućenost, onda je to negativan rezultat. Reakcija je jasnije vidljiva na tamnoj pozadini.

Serum

1. kontrola antigena

2. kontrola seruma