29.06.2020

Активированные лимфоциты в анализе крови человека - что это значит? T-лимфоциты Основные причины повышения лимфоцитов у детей.

При контакте с соответствующим антигеном, представленным прилежащими макрофагами, Т-лимфоциты специфического клона размножаются, выделяя большое число активированных, специфически реагирующих Т-клеток, что соответствует выделению антител активированными В-клетками. Основное различие состоит в том, что в лимфу выделяются не антитела, а целые активированные Т-клетки. Затем они выходят в кровоток и распределяются по телу, проходя через капиллярные стенки в тканевые пространства, оттуда - назад в лимфу и снова в кровь, циркулируя так по всему телу иногда в течение месяцев или даже лет.

Формируются также лимфоцитарные Т-клетки памяти, подобно тому, как формируются В-клетки памяти в системе антител . Это означает, что, когда антиген активирует клон Т-лимфоцитов, многие из вновь образованных лимфоцитов сохраняются в лимфоидной ткани, становясь дополнительными Т-лимфоцитами данного специфического клона; эти клетки памяти равномерно распределяются по лимфоидной ткани всего тела. При последующем появлении того же антигена в любой части тела активированные Т-клетки выделяются гораздо быстрее и в большем количестве, чем во время первого воздействия.

Антиген-представляющие клетки, белки ГКГ и рецепторы для антигенов на Т-лимфоцитах . Реакции Т-клеток в высшей степени антигенспецифичны, как и реакции антител, выделяемых В-клетками, и так же важны в защите против инфекции. Действительно, Т-клетки необходимы как для запуска реакций приобретенного иммунитета, так и для ликвидации внедрившихся патогенов.

В-лимфоциты распознают интактные антигены, в то время как Т-лимфоциты реагируют на антигены только после их связи со специфическими молекулами, называемыми белками ГКГ, на поверхности антиген-представляющих клеток в лимфоидных тканях. К трем главным типам антиген-представляющих клеток относятся макрофаги, В-лимфоциты и дендритные клетки. Дендритные клетки, наиболее мощные из антиген-представляющих клеток, локализуются в теле повсюду, и единственная известная их функция - представлять антигены Т-клеткам.

Для осуществления активации Т-клеток их связь с антиген-представляющими клетками должна быть достаточно продолжительной, и решающее значение для реализации этого условия имеет взаимодействие белков клеточной адгезии.

Белки ГКГ кодируются большой группой генов, которую называют главным комплексом гистосовместимости. Белки ГКГ связывают пептидные фрагменты антигенных белков, разрушающихся внутри антиген-представляющих клеток, и затем транспортируют их к клеточной поверхности. Существует два типа белков ГКГ: (1) белки ГКГ-I, представляющие антигены цитотоксическим Т-клеткам; (2) белки ГКГ-II, представляющие антигены Т-хелперам. Специфические функции цитотоксических Т-клеток и Т-хелперов обсуждаются далее.

Антигены на поверхности антиген-представляющих клеток связываются с рецепторными молекулами на поверхностях Т-клеток так же, как они связываются с белковыми антителами плазмы. Эти рецепторные молекулы состоят из вариабельного элемента, подобного вариабельному участку гуморального антитела, но в этом случае стволовой участок вариабельного элемента прочно связан с клеточной мембраной Т-лимфоцита. На одиночной Т-клетке может быть до 100000 рецепторных участков.

Лимфоциты — это одна из разновидностей белых клеток крови. Лимфоциты составляют примерно от 15 до 40% белых клеток крови. И они являются одними из самых важных клеток иммунной системы, поскольку защищают вас от вирусных инфекций, помогают другим клеткам бороться с бактериальными и грибковыми инфекциями; производят антитела, борются с раком, а также координируют деятельность других клеток иммунной системы.

Два основных типа лимфоцитов -это В-клетки и Т-клетки. В-клетки создаются и созревают в костном мозге, в то время как Т-клетки создаются в костном мозге, но созревают в вилочковой железе («T» как раз и означает «тимус», то есть «вилочковая железа»). В-клетки производят антитела. Антитела помогают организму уничтожать аномальные клетки и инфицирующие организмы, таких как бактерии, вирусы и грибы.

Т-клетки делятся на три группы:

Т-хелперы (от англ. to help — «помогать»; также называются клетки Т4 или CD4+) помогают другим клеткам уничтожать инфицирующие организмы.

Т-супрессоры (от англ. to suppress — «подавлять»; также называются клетки Т8 или CD8+) сдерживают активность других лимфоцитов, так чтобы они не разрушали здоровые ткани.

Т-киллеры (от англ. to kill — «убивать»; также называются цитотоксические Т-лимфоциты или ЦТЛ и являются еще одним видом клеток Т8 или CD8+) распознают и уничтожают ненормальные или инфицированные клетки.

«С» и «D» в CD4 расшифровываются как cluster of differentiation — «кластер дифференциации» и обозначают кластер белков, входящих в состав рецепторов клеточной поверхности. Существуют десятки различных видов кластеров, но чаще всего мы говорим о CD4 и CD8.

Что такое число лимфоцитов CD4?

Клетки Т4. Клетки CD4+. Т-хелперы. Независимо от названия, если вы ВИЧ-положительны, то именно эти клетки важны для вас (Примечание: говоря о «Т-клетках», мы далее всегда будем иметь в виду именно клетки CD4).Зная количество клеток CD4 в крови человека, которое определяется по анализам крови, прописанным врачом, можно сказать, насколько здорова иммунная система и насколько успешно она борется с ВИЧ. Также полезно знать число лимфоцитов CD4 при принятии решения о том, когда нужно начинать антиретровирусную (АРВ) терапию и нужно ли начинать принимать лекарства против СПИД-ассоциированных инфекций.

Задача клеток CD4 состоит в том, чтобы «оповестить» другие клетки иммунной системы, что нужно бороться с той или иной инфекцией в организме. Они также являются главной мишенью ВИЧ, из-за чего их количество во временем снижается. Если клеток CD4 слишком мало, то это значит, что иммунная система работает не так, как надо.

Нормальное количество клеток CD4 — от 500 до 1500 клеток на кубический миллиметр крови (это примерно капля). В отсутствие специфического лечения против ВИЧ количество клеток CD4 уменьшается, в среднем, на 50−100 клеток каждый год. В случае если количество клеток CD4 меньше 200, у человека могут развиваться СПИД-ассоциированные заболевания (оппортунистические инфекции), такие как пневмоцистная пневмония. А если их уровень падает ниже 50−100 клеток, то может развиться и огромное количество других инфекций. По этой причине прием специфических препаратов для профилактики этих инфекций (профилактическое лечение) начинается как только количество лимфоцитов CD4 падает ниже определенного уровня, например, 200 в случае с пневмоцистной пневмонией.

В сочетании с анализом на определение вирусной нагрузки показатель количества клеток CD4 также поможет выяснить, когда начинать АРВ-терапию. Большинство экспертов сходятся во мнении, что АРВ-терапию следует начинать сразу после постановки диагноза.

Что такое доля лимфоцитов CD4?

В бланке результатов клинико-лабораторного исследования можно увидеть графу «доля лимфоцитов CD4+ (%)». Этот показатель имеет большое значение для вас и вашего врача. У здорового взрослого человека число клеток CD4 составляет от 32% до 68% от общего количества лимфоцитов, большой группы белых клеток крови, которые включают в себя клетки CD4, клетки CD8 (см. ниже) и В-клетки. По сути дела, в лаборатории количество клеток CD4 в образце крови определяется через долю клеток CD4.

Зачастую показатель доли клеток CD4 является более точным, чем непосредственное исчисление количества лимфоцитов CD4 в образце крови, поскольку он не так сильно изменяется от анализа к анализу. Например, число лимфоцитов CD4 человека может варьироваться от 200 до 300 в течение нескольких месяцев, тогда как доля лимфоцитов CD4 остается постоянной на уровне, скажем, 21%. Пока доля лимфоцитов CD4 остается на уровне 21% или выше, иммунная система работает нормально, независимо от конкретного количества клеток CD4. В то же время, если доля лимфоцитов CD4 не превышает 13%, независимо от конкретного количества клеток CD4, обычно это означает, что иммунная система повреждена и пора начинать профилактическое лечение (препараты для профилактики заболеваний) с целью предотвращения оппортунистических инфекций, таких как пневмоцистная пневмония.

Что такое количество клеток CD8 и соотношение Т-клеток?

Клетки CD8, которые также называются клетки T8, играют важную роль в борьбе с инфекциями, такими как ВИЧ. У здорового взрослого обычно от 150 до 1000 клеток CD8 на кубический миллиметр крови. В отличие от клеток CD4, у людей, живущих с ВИЧ, клеток CD8, как правило, больше среднего. К сожалению, причины этого в точности не знает никто. Поэтому результаты данного анализа редко используются при принятии решения о лечении.

В результатах клинико-лабораторного исследования также может быть указано соотношение Т-клеток (CD4+/CD8+), то есть количество клеток CD4, деленное на количество клеток CD8. Поскольку количество клеток CD4 у людей, живущих с ВИЧ, как правило, ниже обычного, а количество клеток CD8 обычно выше, их соотношение, как правило, низкое. Нормальное соотношение, как правило, от 0,9 до 6,0. Как и клеток CD8. Некоторые эксперты считают, что обратное соотношение у людей, живущих с ВИЧ, является своего рода двойным ударом со стороны ВИЧ. С одной стороны, он способствует смерти и обновлению Т-клеток, что в итоге снижает уровень клеток CD4. С другой стороны, поскольку из-за вируса иммунная система постоянно борется с воспалением, количество клеток CD8 хронически завышено. Однако большинство экспертов сходятся во мнении, что если с началом АРВ-терапии соотношение Т-клеток увеличивается (т.е. растет число лимфоцитов CD4, а число лимфоцитов CD8 падает), то это является явным признаком того, что медикаментозное лечение работает.

Как выглядят результаты анализа на Т-клетки?

Абсолютное и выраженное в процентах количество Т-клеток обычно указано в разделе «Подмножество лимфоцитов» или «Группа Т-клеток». Именно там перечислены значения различных лимфоцитов вашего организма (CD3+, CD4+ и CD8+), а также другие иммунные клетки. Этот анализ часто называют общим анализом крови. Ниже представлен образец стандартного бланка результатов анализа на Т-клетки.

Определения некоторых терминов, использующихся в анализе на Т-клетки

Абсолютное количество CD3+

Количество CD3+ представляет собой общее число Т-лимфоцитов, которые являются одним из видов белых кровяных телец, созревающих в вилочковой железе. К этим лимфоцитам относятся клетки Т4 и Т8.

Процентная доля CD3

Общее количество Т-лимфоцитов (в том числе клетки Т4 и Т8), выраженное в процентах от общего количества лимфоцитов. Это белые кровяные тельца, которые созревают и находятся в лимфоидных органах тела.

Количество клеток T4

Количество клеток Т4 на кубический миллиметр крови (это примерно капля). Это белые кровяные тельца, которые настраивают иммунную систему на борьбу с болезнью и которые также являются главной мишенью ВИЧ. По мере развития ВИЧ-инфекции количество клеток Т4 снижается с нормального значения в 500−1500 клеток до практически нуля. Когда количество клеток Т4 опускается ниже 200, это означает, что существует повышенный риск развития оппортунистических инфекций, а когда их количество падает ниже 50, риск резко возрастает.

Процентная доля Т4

Количество Т-лимфоцитов, выраженное в процентах от общего количества лимфоцитов. Это белые кровяные тельца, которые созревают и находятся в лимфоидных органах тела. Зачастую показатель процентной доли клеток Т4 является более точным, чем непосредственное исчисление количества лимфоцитов Т4, поскольку он не так сильно изменяется от анализа к анализу.

Количество клеток T8

Количество клеток Т8 на кубический миллиметр крови (это примерно капля). Хотя в бланках большинства анализов они называются супрессорами, на самом деле в их число включены как супрессоры, так и Т-киллеры (см. определения выше). Количество клеток Т8 у людей с ВИЧ, как правило, повышено, но поскольку мало известно о том, почему это так, эти результаты анализа редко используются при принятии решений о лечении.

Процентная доля Т8

Количество лимфоцитов Т8, выраженное в процентах от общего количества лимфоцитов. Это белые кровяные тельца, которые созревают и находятся в лимфоидных органах тела. Зачастую показатель процентной доли клеток Т8 является более точным, чем непосредственное исчисление количества лимфоцитов Т8, поскольку он не так сильно изменяется от анализа к анализу.

Соотношение Т-клеток

Количество клеток Т4, деленное на количество клеток Т8. Поскольку количество клеток Т4 у людей, живущих с ВИЧ, как правило, ниже обычного, а количество клеток Т8 обычно выше, их соотношение, как правило, ниже обычного. Нормальное соотношение, как правило, от 0,9 до 6,0. Как и в случае с клетками Т8, никто точно не знает, что означает пониженное значение. Однако большинство экспертов сходятся во мнении, что если с началом АРВ-терапии соотношение Т-клеток увеличивается (т.е. растет число лимфоцитов Т4, а число лимфоцитов Т8 падает), то это является явным признаком того, что медикаментозное лечение работает.

Дендритные клетки – часть иммунной системы организма. Их сооткрывателем и открывателем ряда их ключевых функций был Ральф Штейнман , за что в 2011 году он получил Нобелевскую премию. По воле случая получилось так, что доктор Штейнман был единственным, кому Нобелевская премия досталась посмертно (сама по себе премия присуждается живым людям). Казус заключался в том, что смерть господина Штейнмана и объявление о присуждении ему премии произошли в один день (в пятницу), но о смерти было объявлено только в понедельник. Комитет Нобелевской премии решил, что технически на момент объявления победителя доктор Штейнман был жив, и ситуацию не стали «переигрывать».

Дендритные клетки (Dendritic cells, DCs) получили свое название за внешнюю схожесть с дендритами нейронов. Они являются частью врожденного иммунитета и играют важную роль в активации адаптивного иммунитета.

Цель заметки – раскрыть базовые принципы активации Т-клеток дендритными клетками и познакомить читателя с необходимой терминологией.

  • Врожденная и адаптивная иммунная система;
  • Общие принципы функционирования врожденной иммунной системы;
  • Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) и pattern recognition receptors (PRRs);
    • Небольшой фокус на дендритных клетках и интерфероне I типа.
  • Коротко о разных видах клеток адаптивной иммунной системы;
  • Дендритные клетки и их функции:
    • Antigen presenting cells и активация Т-клеток;
    • MHC-белки и пептидные «сигнатуры» микробов;
    • Разница MHC I и MHC II;
    • Активация дендритных клеток молекулярными паттернами микробов;
    • CCR7 (рецептор хемокина 7) и миграция в дендритных клеток в лимфоузлы;
    • Циркуляция наивных Т-клеток и попадание их в лимфоузлы;
    • Презентация антигена дендритными клетками и принцип «двойного рукопожатия»;
    • Активация, экспансия и деактивация Т-клеток.

Рассказ не хочется ограничивать исключительно нюансами функций DCs. Хочется, чтобы эта информация накладывалась на какую-то базу о работе иммунной системы. При этом попытки охватить все и сразу не будет. Комплиментарная система, подробности создания и работы антигенов, активация B-клеток и многого-много другого в заметке не будет.

Врожденная иммунная система

Innate immune system (врожденный иммунитет) – мгновенно реагирует на заранее определенное и небольшое количество патогенных паттернов;

Adaptive immune system (адаптивный иммунитет) с задержкой реагирует, но на любое антитело. В последствии запоминая антитело, и в последующие разы реактивно на него реагируя.

Основной клеточный состав врожденной иммунной системы:

  • Циркулирующие в крови клетки:
    • Нейтрофилы, фагоцитируют бактерии, но быстро погибают (в течение часа), секретируют цитокины итд;
    • Моноциты, преобразовываются в макрофаги при попадании в ткани;
  • Дозорные клетки (sentinel cells):
    • Маркофаги, фагоцитоз микробов и мертвых клеток (в основном нейтрофилов), секретируют цитокины, несколько месяцев жизни итд;
    • Тучные клетки (mast cells), секретируют цитокины, гистамины итд;
    • Дендритные клетки, запускают антивирусный ответ, активируют Т клетки итд.

Дозорные клетки находятся в тканях и реагируют на микробы после пересечения последними эпителиальных барьеров кожи и кишечника.

Циркулирующие клетки иммунной системы находятся в крови. И при воспалении попадают в нужные ткани.

Примерный порядок активации врожденного иммунитета:

  • Микробы пересекают эпителиальные барьеры;
  • Рецепторы дозорных клеток опознают «непрошенных гостей»;
  • Дозорные клетки секретируют провоспалительные цитокины;
  • Цитокины связывают на рецепторах эндотелия;
  • Что активирует молекулы адгезии внутри сосудов;
  • Различные молекулы адгезии с разной аффинитивностью связываются с соответствующими лигандами на поверхности циркулирующих иммунных клеток:
    • Например, e-selectin связывается с низкой аффинитивностью с лингадом e-selectin на нейтрофилах, что затормаживает их движение;
    • I-CAM связывается с высокой аффинтивностью с LFA-1 белком иммунной клетки, что останавливает иммунную клетку;
  • После полной остановки иммунные клетки просачиваются с воспаленную ткань и начинают все доступными им способами уничтожать микробы;
  • Первыми приходят нейтрофилы, фагоцитируют бактерии и через пару часов погибают сами; За ними приходят моноциты, превращаются в макрофаги и «подъедают» остатки трупов как микробов, так и нейтрофилов.

Остается вопрос: как дозорные клетки врожденного иммунитета опознают микробы?

PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) – паттерны молекулярных патогенов;

PPRs (Pattern recognition receptors) – рецепторы, опознающие паттеры.PAMPs:

  • Вирусные (находятся внутри клетки):
    • Односпиральные РНК;
    • Двуспиральные РНК
  • Бактериальные (в большей степени на поверхности клетки):
    • Паттерны Грам-отрицательные паттерны:
      • Липополисахариды (LPS) клеточной стенки;
      • Флагеллины («жгутики» для перемещения);
    • Паттерны Грам-положительных бактерий:
      • Флагеллины;
      • Тейхоивые кислоты;
      • Пептидогликаны

Бактерии уничтожаются при помощи фагоцитоза и разрушения их клеточной стенки.

Цепочка будет такой: бактерия связывается с PPRs на поверхности клетки (так называемые TLRs toll like receptors) → димеризация рецепторов и запуск цепочки внутриклеточных сигналов ˧ деактивация ингибитора Nf-Kb → выраженность транскрипторного фактора Nf-Kb → клеточные изменения, в частности секреция цитокинов TNFα и IL-1.

Плазмоцитоидные дендритные клетки и антивирусный ответ

С вирусами ситуация чуть интересней, и тут к нам возвращаются дендритные клетки.

Дендритные клетки реагируют на вирусные PAMPs секретированием интерферонов 1 типа. INF type 1 приводят клетки (например, эпителия) в противо-вирусное состояние. Которое заключается в большей подверженности апоптозу зараженными клетками, выраженности белков/ферментов, которые мешают вирусу размножаться и которые могут наносить урон ДНК/РНК вируса.

Сами клетки в противовирусном состоянии также способны секретировать INF type 1.

Дендритные клетки

Необходимые вводные закончились, пора приступить к antigen presenting cells. К антиген презентующим клеткам относятся дендритные клетки, макрофаги и B-клетки.

В дальнейшем речь будет идти о том, как DCs активируют Т-клетки адаптивной иммунной системы.

Т-клетки, MHC I и MHCII

Т клетки своими рецепторами могут воспринимать только пептиды, представленные им на MHC белках антиген презентующих клеток.

MHC II

  • Отвечает за бактерии;
  • Дендритные клетки интернализируют бактерии, уничтожают их в лизосомах, в итоге мы получаем пептидную «сигнатуру» бактерии;
  • MHC с пептидом отправляется к мембране;
  • MHC II связываются с рецепторами CD4+ клеток (T helpers, которые активируют B-клетки и клетки врожденной иммунной системы;
  • MHC II есть у антиген презентующих клеток.

MHC I

  • Отвечает за вирусы (тему опухолей пропустим);
  • Вирусный белок проходит юбиквинацию и становится доступных протеазам;
  • Протеаза «расщепляет» вирусный белок до пептидов;
  • Вирусный пептид с помощью транспортера TAP попадает в эндоплазматический ретикулум, откуда с MHC I комплексом попадает на мембрану;
  • MHC I активирует CD8+ клетки (цитотоксичные T клетки, которые уничтожают зараженные вирусы;
  • MHC I есть у большинства клеток, что объясняется особенностью вирусов.

Дендритные клетки. Активация и миграция в лимфоузлы

Для активации дендритных клеток должно произойти 2 события:

  • MHC белок с пептидом микроба на поверхности клетки (значит он был так или иначе интернализирован и расщеплен до пептидов);
  • PAMP рецепторы дендритных клеток должны быть активированными микробами;

При выполнении двух этих условий дендритные клетки выражают CD80/CD86 (подробнее чуть позже) и CCR7 (хемокин рецептор 7), выраженность которого приводит к тому, что DCs мигрируют в лимфососуды и по ним попадают во вторичные лимфо-органы. В частности, в лифмоузлы, где в межмембранном пространстве встречаются с Т-клетками.

Дендритные клетки активируют Т клетки

Т-лимфоциты путешествуют по крови по попадают с мемфоликулярное пространоство лимфоузлов при помощи кровотока и так называемых High endothelial venules (HEV).

Дело в том, что Т-клеток, аффинитивных определенному антигену, очень немного. Поэтому они путешествуют по организму, заходя ненадолго в лимфоузлы, куда активированные дендритные клетки попадают из тканей.

Для активации Т-клеток должно пройти 2 сигнала:

Сигнал 1. Антиген должен связаться с рецептором Т-клетки (нужна Т клетка с необходимой аффинитивностью рецептора;

Сигнал 2. Костимулирующие молекулы должны соединиться. Это B7-1 (CD80) и B7-2 (СD86) на стороне DCs и CD-28 на стороне Т-клеток.

Сигнал 1 без сигнала 2 приведет к апоптозу или анергии (угасание активной иммунной функции) Т-клетки.

После активация Т клетки проходят clonal expansion, активно делятся, их становятся десятки тысяч в случае с CD4+ и даже сотни тысяч в случае CD8+. Плюс Т-клетки после активации приобретают некоторые полезные фукнции.

Я опущу вопрос активации B-клеток Т-клетками, вопрос более глубокой функции T helpers и T killers. Остановлюсь только на активации Т клеток. В ткани они попадают примерно также, как циркулирующие в кроки клетки врожденной иммунной системы (см выше).

Деактивация Т-клеток

Любое воспаление (особенно цитотоксичное) чревато последствиями для организма. И этот процесс на уметь «тормозить».

В лимфоузлах это за это отвечает белок CTLA4 на Т-клетках, который связывается вместо CD28 с B7-1/B7-2. Это приводит к тому, что во время активации у нас будет только сигнал 1 и Т клетка будет неактивной.

Ткани (и опухоли) выражают PD-1 лиганд (PD-1, programmed death), который связывается с PD-1 белком Т-клеток, что приводит к их exhaustion (истощению), то есть деактивации.

Моноклональные антитела, подавляющие функции CTLA-4 и PD-1, одно из последних слов в борьбе с раковыми заболеваниями.

Выводы:

  • Дендритные клетки активируются двумя сигналами:
    • MHC белком на мембране, на котором будет пептидный антиген;
    • PAMPs микробов связывается с рецепторами DCs;
  • Активированные дендритные клетки выражают CCR7, что позволяет им мигрировать через лимфо-сосуды в лимфоузлы и «искать» в междфоликулярном пространстве нужную Т-клетку;
  • Активация Т-клеток включает в себя 2 сигнала:
    • Сигнал 1 MHC с пептидом (антигеном) связываются с нужным TCR (T cell receptor);
    • Сигнал 2, костимуляция CD86/CD80 DCs с CD28 Т-клеток;
  • При наличии только сигнала 1 Т-клетки подвергаются апоптозу или анергии;
  • После активации начинается экспансия и дифференциация Т-клеток, которая является одним из компонентов ответа иммунной системы.

Источники:

  1. Торможение лейкоцитов молекулами адгезии [видео];

P.S. Это было писать скучно, в виду пересказа без моего вклада, но необходимо для ряда последующих заметок.

Словарь по итогам заметки:

  • Врожденная иммунная система:
    • Дозорные клетки (тучные, макрофаги, дендритные – это только основные, есть и другие);
    • Циркулирующие клетки (моноциты, нейтрофилы);
    • Также врожденная иммунная система включает в себя барьеры (эпителий, муцин), белки и молекулы (комплименты, агглутинины);
  • Адаптивная иммунная система: B-клетки, T-помощники, цитотоксичные Т-клетки;
  • Дендритные клетки:
    • MHC I,
    • MHC II
    • B7-1 (CD80)
    • B7-2 (CD86)
  • Т-клетки:
    • CD28
    • CTLA4
  • Клональная селекция;
  • Клональная экспансия
  • Антиген-презентующие клетки (DCs, макрофаги, B-клетки);
  • Анергия


Под активацией клеток понимают их переход из состояния покоя в функционально активное состояние - макрофаги продуцируют активные формы кислорода, тучные клетки выбрасывают гранулы, мышечные клетки сокращаются и т.д. В случае лимфоцита активация также означает выход из состояния покоя (G0), но в несколько ином смысле: покоящийся лимфоцит находится вне клеточного цикла, а его активация означает вступление в цикл. Это последствие активации лимфоцитов глубоко функционально, поскольку любому проявлению функции лимфоцитов должно предшествовать их размножение (поскольку исходная численности клеток в каждом клоне мала). Это не относится к естественным киллерам - лимфоцитам, популяция которых не имеет клональной структуры. Активация NK-клеток не связана с пролиферацией и означает переход в состояние готовности выполнять цитотоксическую функцию.
Молекулярные основы активации Т-клеток
Активация клеток, в том числе лимфоцитов, всегда сопряжена с экспрессией многих генов. В случае лимфоцитов активация должна приводить прежде всего к экспрессии генов, обеспечивающих пролиферативную экспансию клона. Суть подготовки Т-клеток к пролиферации состоит прежде всего в экспрессии генов аутокринного ростового фактора - IL-2 и его рецептора, а точнее a-цепи этого рецептора, обеспечивающей достижение необходимого уровня сродства к цитокину, что служит условием выполнения рецептором его функций. Оба эти гена являются индуцибельными, т.е. в покоящемся состоянии они выключены, но экспрессируются в ответ на индуцирующее воздействие. Сигнал к включению гена поступает из его регуляторного (промоторного) участка, в котором расположены сайты специфического взаимодействия с определенными белками - транскрипционными факторами. Некоторые их таких белков исходно представлены в клетке в активной форме, но большинство отсутствует и может быть синтезировано de novo или активировано путем фосфорилирования или удаления ингибирующей субъединицы. Таким образом, молекулярная основа активации - образование необходимых транскрипционных факторов, обеспечивающих включение индуцибельных генов.
На Т-лимфоциты активирующее воздействие оказывают индукторы активации. В физиологических условиях таким индуктором служит антигенный стимул. Само по себе распознавание антигена при контакте Т-хел- пера с АПК не может повлиять на активность гена в силу пространственной разобщенности мембранного рецептора и генов, локализующихся в ядре. TCR проникает внутрь клетки после связывания с антигеном, но не для того, чтобы мигрировать в ядро и повлиять на активность гена, а для того, чтобы быть расщепленным. Однако при связывании антигенного комплекса с TCR в сочетании с костимулирующим воздействием возникает сигнал, достигающий ядра и регулирующий экспрессию генов. Передача сигнала осуществляется по каскадному принципу. На разных этапах передачи сигнала ее осуществляют молекулы ферментов (главным образом, протеинкиназы, активирующие белки на каждой очередной стадии передачи сигнала), а также адапторные и ГТФ-связывающие белки. Сигнал исходно является двойственным, поскольку его передача осуществляется одновременно от TCR и CD28. Затем эти пути пересекаются и вновь разделяются на несколько ветвей. Конечный результат передачи сигнала по каждому сигнальному пути - формирование транскрипционного фактора. На рис. 3.90 представлена типовая схема внутриклеточной передачи сигнала, завершающейся формированием транскрипционных факторов и активацией генов. Для активации Т-клеток требуется формирование трех транскрипционных факторов - NF-AT, NF-kB и AP-1. Далее рассмотрим осуществление внутриклеточной передачи сигнала на примере активации Т-хелперов при распознавании презентируемого дендритными клетками антигена.
Связывание комплекса MHC-II-пептид вызывает конформационные изменения молекулы TCR и связанной с ней молекулы корец ептора CD4. Пока окончательно не известно, происходит ли при этом только изменение конформации рецепторов или они олигомеризуются. Такие изменения активируют тирозинкиназы, ассоциированные с рецептором и корецеп- тором - Lck (p56lck), связанную с CD4, и Fyn (p59fyn), связанную с CD3. Указанные тирозинкиназы называют рецепторными, или проксимальными, в связи с тем, что они непосредственно примыкают к рецептору, входя в рецепторный комплекс. Обе упомянутые киназы относят к семейству Src-киназ. Киназы этого семейства содержат домены SH1, SH2 и SH3 (SH - от Src-homology) (рис. 3.91). Первый домен обладает ферментативной активностью, остальные взаимодействуют с другими киназами и адапторными белками. Функция тирозинкиназ состоит в фосфорилировании по остатку тирозина белков-мишеней, что необходимо для их активации и проявления функций, в том числе ферментативных. Мишени рецепторных киназ многочисленны. К ним относят сами молекулы Fyn и Lck (что обусловливает их аутофосфорилирование), а также полипептидные цепи TCR и другие киназы. Особенно многообразны мишени киназы Lck.
Однако первоначальным условием активации рецепторных киназ является, наоборот, их дефосфорилирование, обеспечивающее пере-

ход из гиперфосфорилированного в нормальное состояние. Дело в том, что в покоящейся клетке SH2-домен киназы Lck находится в свернутой форме вследствие фосфорилирования С-концевого остатка тирозина Y505 конститутивно активированной киназой Csk. Фосфорилированный Y505 взаимодействует с помощью фосфатной группы с остатком тирозина в Sffi-домене, к которому и подтягивается С-конец молекулы. В таком виде фермент не активен, поскольку при этом не может быть фосфори- лирован функционально важный остаток Y394 в домене SH1. Для снятия такой функциональной блокады необходимо дефосфорилирование с последующим развертыванием молекулы, что осуществляется с участием тирозинфосфатаз. Основную роль в переводе рецепторных киназ в «рабочее» состояние выполняет молекула CD45, цитоплазматический домен которой обладает активностью тирозинфосфатазы. Ранее уже упоминалось, что эта крупная молекула, препятствующая формированию тесного контакта между дендритной клеткой и Т-хелпером, вначале удаляется из зоны иммунного синапса, а затем часть молекул возвращается в эту зону для выполнения своей функции - дефосфорилирования молекул рецепторных тирозинкиназ. После того как остаток Y394 становится доступным для фосфорилирования, Lck может проявлять активность тирозинкиназы.
В генерации сигналов, передаваемых от полипептидных цепей комплекса TCR-CD3, наиболее важно наличие в цитоплазматическом участке у-, 5-, е- и Z-цепей активационной последовательности ITAM, о которой уже неоднократно упоминалось. Структура этого мотива такова: YXXI/L/ VX(6-8)YXXI/L/V (где Y - тирозин, Х - любой остаток, I/L/V - изолейцин, лейцин или валин) (рис. 3.92). Фосфорилирование остатков тирозина

Рис. 3.92. Сопоставление характеристик активационных и ингибирующих мотивов (ITAM и ITIM)


в ITAM делает этот участок доступным для распознавания аналогичными участками сигнальных молекул, расположенных более дистально. Среди полипептидных цепей TCR наиболее важна для передачи сигнала Z-цепь. В отличие от у-, 5- и е-цепей TCR, имеющих по одному участку ITAM, в цитоплазматической части Z-цепи расположены 3 последовательности ITAM, предназначенные для взаимодействия с остатками тирозина тирозинкиназы ZAP-70 (от Z-associated protein - ^-ассоциированный белок; масса 70 кДа) - ключевого фактора в передаче сигнала от TCR при его связывании с лигандом. Фосфорилирование Z-цепи является наиболее ответственным и в то же время наиболее уязвимым этапом активации Т-клеток. Полагают, что именно для обеспечения фосфорилирования всех мотивов ITAM этой молекулы необходимо длительное поддержание контакта Т-лимфоцитов и дендритных клеток. В Z-цепи покоящейся Т-клетки фосфорилирован 1 остаток тирозина; отсутствие фосфорилирования приводит к развитию апоптоза (рис. 3.93). После взаимодействия Z-цепи и ZAP-киназы запус-


Рис. 3.94. Схема сигнальных путей при активации Т-клеток. Распознавание комплекса молекулы МНС с антигенным эпитопом в сочетании с костимуляцией индуцирует запуск сигналов, передаваемых в ядро с помощью 5 каскадов, обеспечивающих формирование 3 транскрипционных факторов, необходимых для активации клетки. Жирным контуром обведены факторы, для которых показана высокая степень зависимости от костимуляции

кается полномасштабный процесс в виде нескольких параллельных путей передачи активационного сигнала (рис. 3.94).
Молекулу ZAP-70 относят к тирозинкиназам семейства Syk. Она содержит тандем из двух SH2-доменов. Условие ее взаимодействия с фцепью - предварительное фосфорилирование остатков тирозина в ITAM фцепи. После фосфорилирования 2-й остаток тирозина в мотивах ITAM фцепи взаимодействует с тирозином S^-доменов киназы ZAP-70. В результате фосфатная группа тирозина фцепи становится общей с тирозином Sffi-домена молекулы ZAP-70. За этим следует фосфорилирование остатков тирозина в ферментативном домене молекулы ZAP-70, осуществляемое тирозинкиназами Lck и, возможно, Fyn, что приводит к включению ферментативной (киназной) активности молекулы.
Дальнейшая передача сигнала обусловлена взаимодействием ZAP-70 с ее главным субстратом - адапторным белком LAT (от Linker for activation of T-cells - линкер активации Т-клеток). Этот белок связан с мембраной и входит в состав рафтов. После катализируемого ZAP-70 фосфорилирования LAT приобретает способность связывать сигнальные молекулы, участвующие в дальнейшей передаче сигнала: адапторные белки SLP-76, Grb2, фактор Vav, а также ферменты - PLCy1 и PI3K. Активация некоторых из упомянутых белков зависит от LAT не напрямую, а косвенно. Так, через SH3-домены


адапторных белков семейства Grb2 к сигнальному пути подсоединяются факторы SLP-76 и Sos. SLP-76, в свою очередь, опосредует подключение к сигнальному пути PLСy1 и ГТФазы Ras. Активация PLCy1 происходит с участием тирозинкиназы Itk, относящейся к семейству Btk - третьему (после Src и Syk) семейству тирозинкиназ, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала при активации лимфоцитов. Все сигнальные факторы, вовлекаемые в процесс активации с прямым и косвенным участием LAT, рекрутируются в состав клеточной мембраны и взаимодействуют с ее фосфоинозитидными компонентами. Комплекс, образуемый при взаимодействии SLP-76, Vav и Nck, реагирует с белками цитоскелета PAK и WASP, служащими медиаторами перестроек в цитоскелете активируемых клеток.
Активированная PLCy1 катализирует расщепление фосфатидилино- зитол 4,5-бифосфата с образованием диацилглицерола (DAG), который остается связанным с мембраной, и инозитол-1,4,5-трифосфата (рис. 3.95). Инозитол трифосфат поступает в цитоплазму и взаимодействует с рецепторами на поверхности эндоплазматического ретикулума, что обусловливает выход ионов Са2+ из внутриклеточных хранилищ. Опустошение последних вызывает открытие Са2+-зависимых каналов в клеточной мембране, через которые в клетку поступают ионы Са2+ из внеклеточного пространства. В результате возрастает концентрация свободных ионов Са2+ в цитоплазме клетки. Ионы Са2+ активируют фосфатазу кальциневрин, дефосфорилиру- ющую цитоплазматический компонент транскрипционного фактора NF-AT (Nuclear factor of activated T-cells - ядерный фактор активированных Т клеток) (рис. 3.96). Это обусловливает перемещение фактора в ядро, взаимодействие с ядерным компонентом и формирование зрелой формы молекулы NF-AT, способной взаимодействовать с ДНК в промоторных участках генов, вовлеченных в активацию Т-клеток (IL2, IL2R и др.).
Диацилглицерол традиционно рассматривали как фактор, активирующий протеинкиназу С (PKC) - уже не раз упоминавшуюся ранее серин/тре-


Рис. 3.96. Са2+-зависимое звено активации Т-клеток и его блокада циклоспорином А. Зависимый от инозитолтрифосфата сигнальный путь приводит к мобилизации в ядро транскрипицонного фактора NF-AT. Этот путь может быть блокирован циклоспорином А, способным в комплексе с циклофиллином инактивировать фосфатазу кальциневрин, ответственную за дефосфорилирование цитоплазматического фактора NF-AT (что служит условием его миграции в ядро)

ониновую киназу, признаваемую одним из ключевых факторов активации Т-клеток. Однако оказалось, что изоформы РКС, активируемые диацил- глицеролом, не имеют отношения к активации Т-клеток. В ней участвует изоформа 0 РКС, появляющаяся в иммунном синапсе на пике его «зрелости». Ее рекрутирование в иммунный синапс зависит от активности Р13К и Vav (последний фактор связан с цитоскелетом, роль которого в транспорте РКС0 очень важна). Поскольку активация Vav зависит от сигнализации не только через TCR, но и через CD28, а CD28-зависимый путь реализуется с участием PI3K (она ассоциирована с CD28 - см. далее), становится очевидным, что PI3K и Vav представляют различные этапы одного сигнального пути и, таким образом, вовлечение в активацию молекулы РКС0 зависит от костимуляции через CD28. При этом не вызывает сомнений роль в активации РКС0 сигналов, поступающих от TCR, поскольку РКС0 фосфорили- руется (и, следовательно, активируется) киназой Lck. Допускают участие в активации РКС0 и других факторов, в том числе диацилглицерола, но эти влияния второстепенны. Активация PKC0 необходима для предотвращения апоптоза активируемых клеток и включения двух из трех критических транскрипционных факторов, необходимых для экспрессии генов IL2 и IL2R - АР-1 и NF-kB. РКС0-зависимая активация АР-1 реализуется через Rac/JNK-ветвь MAP-каскада (о нем будет сказано далее). Путь, приводящий к активации транскрипционного фактора NF-kB, содержит в качестве

промежуточных звеньев последовательно активируемые (с участием PKC0) факторы CARMA-1, Bcl-10 и MALT-1, IKK. IKK фосфорилирует ингибирующую субъединицу NF-kB - IkK, придавая ей способность к связыванию убиквитина, что предопределяет ее последующую деградацию. При этом освобождается активная субъединица NF-kB, мигрирующая в ядро и выступающая в роли транскрипционного фактора - одного из трех, необходимых для экспрессии генов активации Т-клеток. Транскрипционный фактор NF-kB, играющий ключевую роль при активации клеток врожденного иммунитета, был рассмотрен выше (см. раздел 2.2.4).
Столь же широко при активации клеток используется еще один сигнальный путь, запускаемый при активации Т-лимфоцитов - MAP-каскад, или MAP-модуль (от Mitogen-activated kinases - киназы, активированные мито- геном). Его роль состоит главным образом в индукции транскрипционного фактора АР-1 (димера c-jun/c-fos). Существует 3 ветви этого каскада, приводящие к образованию трех типов MAP-киназ (MAP^ - ERK1/ERK2 (от Extracellular signal-regulated kinases - киназы, регулируемые внеклеточными сигналами), p38 и JNK (от c-Jun NH2-terminal kinases - c-Jun NH2-концевые киназы). Каскады, приводящие к активации MAP-киназ, включаются с участием адапторных белков и низкомолекулярных ГТФаз. Один из адап- торных белков - Grb2 (Growth factor receptor bound protein 2), активируется при взаимодействии с фактором LAT. Активированный Grb2 спонтанно связывается с другим LAT-активированным белком SLP-76 и фактором Sos (от Son of sevenless). Sos представляет фактор замещения гуаниннуклеотидов: он обусловливает замещение ГДФ на ГТФ в составе малых G-белков (т.е. белков, связывающих гуаниннуклеотиды). Поэтому комплекс SLP-76/Grb2/Sos обусловливает активацию G-белка Ras, превращая связанный с ним ГДФ в ГТФ. Ras-ГТФ активирует серин/треониновую киназу Raf (киназу киназы MAP-киназы - МККК). Далее следует каскад реакций: Raf активирует МЕК (киназу MAP-киназы - МКК), а МЕК активирует вышеупомянутые MAP-киназы ERK1 и ERO. Активацию JNK-ветви MAP-каскада инициирует упоминавшийся выше фактор Vav (зависимый от LAT и связанный с активацией цитоскелета, а также РКС0, см. выше). Он вызывает переход ГДФ в ГТФ в комплексе с G-белком Rac (семейство Rho). Rac-ГТФ активирует киназу МЕКК (выступающую в роли МККК), она активирует киназу JNKK (MKK), которая, в свою очередь, активирует MAP-киназу JNK. Третий путь MAP-модуля, приводящий к образованию MAP-киназы р38, также зависит от G-белков семейства Rho. Он аналогичен по общей схеме двум другим путям, но изучен менее детально.
Активация MAP-киназ ERK1/ERK2, JNK и p38 осуществляется путем фосфорилирования остатков треонина и тирозина в мотиве TXY, причем роль Х в трех типах киназ выполняют различные остатки (соответственно Glu, Pro и Gly). Названные MAP-киназы обусловливают формирование транскрипционных факторов, участвующих во многих клеточных процессах. ERK1/ERK2 обусловливает образование транскрипционных факторов АР-1 и Elk-1, JNK - факторов ATF2, Elk-1 и c-Jun (компонент АР-1), p38 - факторов ATF2, Elk-1 и MEF-2C.
Запуск рассмотренных выше сигнальных путей при активации Т-клеток происходит при параллельном связывании TCR и костимуляции через молекулу CD28. Дифференцирование сигнальных путей, включаемых через эти мембранные молекулы, а также расшифровка взаимодействия этих путей до конца не завершены. Однако общая картина проявляется достаточно четко, чтобы в общих чертах понять молекулярные основы костимуляции. При связывании TCR, координированном со связыванием корецептора, происходит изменение конформации комплекса TCR-CD3, CD4 вызывает активацию рецепторных тирозинкиназ Fyn и Lck, а также фосфатазы CD45. Конечный результат «проксимальных» событий - фосфорилирование Z-цепи рецепторного комплекса и передача активационного сигнала на киназу ZAP-70. Далее с участием адапторных белков LAT, SLP-76 и Vav область, вовлеченная в передачу сигнала, существенно расширяется, включая мембранно-связанные киназы, цитоскелет и малые G-белки. Сигнальный путь, приводящий (через активацию PLCyl, образование инозитолтрифосфата и активацию кальциневрина) к мобилизации Са2+ и активации транскрипционного фактора NF-AT, по-видимому, реализуется без прямого участия сигналов, генерируемых при костимуляции. Другие пути в большей или меньшей степени зависят от костимулирующего сигнала.
Наиболее прямое следствие костимуляции через CD28 - активация мембранного фермента PI3K, физически связанного с молекулой CD28. Этот фермент катализирует образование фосфатидилинозитол 4, 5-бифосфата, служащего источником инозитолтрифосфата. Однако это событие напрямую не связано с активацией и может рассматриваться как подготовительное. При активации клетки фосфатидилинозитолтрифосфат активирует Vav - узловой фактор, ответственный за вовлечение в процесс активации цитоскелета и участвующий в рекрутировании и активации протеинкиназы PKC0. Этот фермент важен для функционирования сигнального пути, приводящего к формированию транскрипционных факторов NF-kB и АР-1. В обоих случаях роль PKC0 в наибольшей степени проявляется во включении Rас/JNK-ветви MAP-каскада. Raf/ERK- и Rac/p38-ветви MAP-каскада в меньшей степени зависят от PKC0, а следовательно, от костимуляции. Таким образом, молекулярная основа костимуляции - вовлечение в процесс активации Т-хелпера сигнальных путей, реализуемых с участием трех ключевых факторов - PI3K, фактора Vav и изоформы 0 протеинкиназы С. Из трех ключевых транскрипционных факторов, запускающих гены активации Т-клеток, экспрессия двух (АР-1 и NF-kB) зависит от костимуляции и только для выработки NF-AT непосредственно костимуляция не требуется.
Таким образом, в результате в Т-клетке формируется 3 транскрипционных фактора - NF-AT, NF-kB AP-1. Формирование этих факторов происходит различными путями. Активный NF-AT образуется в результате сборки димера, включающего цитоплазматический и ядерный субкомпоненты NF-AT - NF-ATc и NF-ATn. Если NF-ATn - конститутивный фактор, всегда присутствующий в ядре Т-клетки, NF-ATc должен быть активирован для миграции в ядро, что достигается его дефосфорилированием, катализируемым кальциневрином (см. выше). Транскрипционный фактор NF-kB активируется путем отщепления от комплекса IkB-NF-kB ингибирующей субъединицы IkB. Как уже говорилось выше, это происходит при фосфорилировании IkB киназой IKK, активируемой с участием РКС0. Фосфорилированная субъединица становится доступной для деградации



по убиквитиновому пути. Фактор АР-1 - димер белковых продуктов двух индуцибельных протоонкогенов - c-fos и c-jun. Для экспрессии этих генов и синтеза белков необходимы соответствующие транскрипционные факторы, а именно Elk-1 (для c-fos) и JNK (для c-jun). Как уже было указано выше, Elk-1 и JNK - конечные продукты деятельности различных ветвей MAP-каскада. Синтезируемые de novo белки c-fos и c-jun образуют гомо- и гетеродимеры, формирующие транскрипционный фактор АР-1.
Рассмотренные три фактора (NF-AT, NF-kB и AP-1) нужны для индукции генов активации Т-клеток - в первую очередь IL2 и IL2R. Промоторный участок гена IL2 содержит 9 сайтов связывания транскрипционных факторов (рис. 3.97). Среди них есть 2 участка связывания октомера Oct, не лимитирующего процесс индукции гена. Из трех ключевых транскрипционных факторов NF-kB взаимодействует с промотором в одном сайте, не зависимом от других транскрипционных факторов. Два других фактора - NF-AT и AP-1 - взаимодействуют с промотором как отдельно друг от друга (по 1 сайту связывания), так и в комплексе (3 сайта связывания). Заполнение всех сайтов соответствующими транскрипционными факторами, приводящее к индукции гена, служит конечным результатом передачи сигнала при активации Т-клеток.
Выше были подробно рассмотрены сигнальные пути, участвующие в активации Т-хелперов. Активация цитотоксических Т-клеток осуществляется по сходным механизмам.
3.5.2.2. Проявления активации Т-клеток
Активация CD4+ Т-клеток (как и любых Т-лимфоцитов) приводит к экспрессии большого числа генов, среди которых наибольшую роль в реализации основных эффекторных событий играют гены IL2 и IL2R, кодирующие соответственно цитокин IL-2 и a-цепь его рецептора. Экспрессия гена IL2 происходит примерно через 1 ч после получения стимулирующего сигнала. Секрецию белка IL-2 стимулированными Т-клетками in vitro выявляют через 3-4 ч; она достигает пика через 8-12 ч и прекращается через 24 ч. In vivo секреция IL-2 начинается через 1-3 сут после введения антигена


Рис. 3.98. Временная динамика экспрессии молекул активации Т-клеток. На графи
ке представлены сроки экспрессии ключевых молекул активации после стимуляции Т-клеток

(иммунизации) и сохраняется в течение 7-12 сут. Экспрессия a-цепи рецептора IL-2 происходит несколько позже и продолжается дольше - in vitro ее выявляют через 4 ч после стимуляции; максимума она достигает через 2-3 сут и прекращается через 5 сут (рис. 3.98).
Одновременно с геном IL2 в кратчайшие сроки после действия стимулятора (в физиологических условиях - антигенного комплекса пептид-MHC) экспрессируются гены с-Myc и N-Myc, называемые ранними активационными генами. Они участвуют в подготовке клеток к митозу. Через 2-3 ч на поверхности Т-клетки появляется CD69 - самый ранний активационный антиген, частично мобилизуемый из внутриклеточных депо, а частично экспрессируемый de novo. Его экспрессия продолжается немногим более суток. Вскоре после CD69 на поверхности клетки появляется другой ранний маркер активации - CD25, представляющий уже упомянутую a-цепь рецептора для IL-2. Несколько раньше выявляют экспрессию ряда цитоки- новых генов и синтез ограниченных количеств соответствующих цитокинов (IFNy, IL-4, IL-5, IL-6).
Следующие проявления активации наблюдают через сутки после действия стимулятора, когда экспрессируется молекула рецептора для транс- феррина (CD71). Этот фактор играет важную роль в пролиферации, поскольку для ее осуществления необходимы ионы железа. В последующие дни (3-6 сут) экспрессируются молекулы MHC-II, относимые к поздним маркерам активации Т-клеток, а затем - р1-интегрины, обозначаемые как очень поздние активационные антигены - VLA (Very late activation antigens), и секретируются хемокины. Эти поздние проявления активации клеток совмещаются с пролиферативным процессом.

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Ученые объединили методы иммунотерапии, цитотерапии и генотерапии для перепрограммирования Т-лимфоцитов в потенциальных «убийц» раковых клеток. Но и этого оказалось недостаточно - следующим шагом стало создание молекулярного «выключателя», с помощью которого можно регулировать время и силу действия активированных Т-клеток. Инновационный метод закладывает основу для резкого сокращения серьезных (а иногда и смертельных) побочных эффектов, вызванных терапией с использованием модифицированных Т-клеток.

Обратите внимание!

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни ». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon .

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science .

Медицина перешла на новый уровень: клетки стали живым лекарством

В последнее время в терапии опухолевых заболеваний особое внимание уделяется адоптивной иммуноцитотерапии (от англ. adoptive - приемный). При этом часть клеток иммунной системы пациента искусственно «натравливают» на опухолевые клетки. Суть метода состоит в том, чтобы отобрать у пациента необходимые иммунные клетки, обработать их - например, иммунными цитокинами (небольшими белками, выполняющими функции регуляторов деления и дифференцировки специфических иммунных клеток), - а затем вернуть в организм уже активированные клетки, которые и будут помогать бороться с опухолями* (рис. 1).

* - Эта тема является одной из самых горячих направлений клинической иммунологии - см. статью «Хороший, плохой, злой, или Как разозлить лимфоциты и уничтожить опухоль » . - Ред.

Впервые метод адоптивной иммуноцитотерапии был описан еще в 1988 году - у пациентов с метастатической меланомой (то есть раком кожи на четвертой стадии) наблюдалась регрессия заболевания при терапии с помощью их TIL-клеток (лимфоцитов, инфильтрующих опухоль) . В настоящее время терапия метастатической меланомы на основе TIL-клеток является наиболее эффективным способом лечения данного заболевания, поскольку регрессия опухоли наблюдается у половины пациентов .

Существует несколько вариантов клеток, которые используются в адоптивной иммунотерапии; из них три используются при терапии опухолевых заболеваний: уже знакомые нам TIL-клетки (лимфоциты, инфильтрующие опухоль), LAC-клетки (лимфокин-активированные киллеры) и CIK-клетки (цитокин-индуцированные киллеры). На самом деле собственные Т-клетки организма тоже стараются бороться с опухолевыми клетками, только зачастую опухолевые клетки им «не по зубам». Не то, чтобы совсем - ведь существует иммунный надзор, осуществляемый Т-клетками и естественными киллерами (NK-клетками), с помощью которых иммунная система старается защититься от опухолей, - однако это вовсе не стопроцентная защита. Однако случается, что иммунный надзор не всегда достаточно силен, чтоб предотвратить развитие опухолей: так, при длительном применении иммунодепрессантов после трансплантаций органов повышается частота развития многих опухолей .

Необходима система наведения

Несмотря на сложность получения модифицированных клеток, а также сопутствующий риск возникновения серьезных побочных эффектов, все же главной проблемой метода иммуноцитотерапии является отсутствие способов прицельной доставки вводимых модифицированных иммунных клеток в опухоль. Раковые клетки часто делаются практически «невидимыми» для иммунной системы, и они образуют микросреду, которая подавляет активность и миграцию Т-клеток . Для того, чтобы сбросить мантию-невидимку с опухолевых клеток, Т-лимфоциты надо не только активировать, но и придать им способность прицельно узнавать опухолевые клетки. Т-клетки могут быть перепрограммированы методами генной инженерии путем введения генов, кодирующих рецепторы к опухолевым антигенам (TAA, tumour-associated аntigens) - оснащения собственной «системой наведения». Также можно заодно ввести гены для придания Т-клеткам устойчивости к иммуносупрессии для увеличения выживаемости или облегчения проникновения сконструированных Т-клеток в опухоль. В итоге, могут быть получены высокоактивные «наемные убийцы» раковых клеток .

Для получения эффективных «убийц» Т-лимфоциты модифицируют путем оснащения их искусственными химерными антигенными рецепторами (CAR, chimeric antigen receptors). Рецепторы химерные, поскольку одна часть (распознающая) была «позаимствована» у моноклональных антител, а часть, передающая сигнал, - у Т-клеточного рецептора (ТCR). В качестве внеклеточной «распознающей» части обычно служат вариабельные домены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов необходимой специфичности (scFv), которые образуют специфичный к опухолевым клеткам антиген-связывающий участок (рис. 2).

Рисунок 2. Структура химерного антигенного рецептора (CAR). CAR состоит из внеклеточного домена (одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела (scFv)), соединенного с помощью цепей и трансмембранных доменов с цитоплазматической сигнальной областью. Гены, кодирующие scFv, получены из В-клеток, продуцирующих антитела, специфичные к опухолевому антигену. CAR существует в виде димера, и распознавание опухоли происходит напрямую (без участия MHC). Рисунок из .

Все новое - это хорошо забытое старое. Первые Т-клетки с химерным антигенным рецептором были получены командой ученых под руководством профессора Эсхара (Zelig Eshhar ); результаты работы были опубликованы еще в 1989 году . Эсхар понял, что, обладая данной техникой, Т-клетки можно запрограммировать на нацеленную атаку.

Однако с момента обнаружения химерных антигенных рецепторов до внедрения технологии в практику прошло больше 20 лет. За это время были улучшены химерные антигенные рецепторы - были созданы CAR 2-го поколения, в которые был внесен дополнительный сигнальный домен костимулирующей молекулы, который позволил улучшить активацию Т-клеток и их распространение. В CAR 3-го поколения был добавлен еще один сигнальный домен, что в конечном итоге повысило уровни выживания и размножения модифицированных Т-клеток (рис. 3). В конечном итоге были улучшены способность к «выслеживанию» опухолевых клеток, а также уменьшены побочные эффекты.

Рисунок 4. Бутылка с питательной средой для Т-клеток , которые после введения в них нового рецептора выращивают около 10 дней до достижения ими количества в несколько миллиардов. Тогда они могут быть введены в вены пациента. Рисунок из .

Первые клинические испытания генетически модифицированных Т-лимфоцитов, несущих химерные антигенные рецепторы, прошли в 2012 году. Они выпали на долю девочки по имени Эмили, больной острой лимфобластной лейкемией. После того, как генетически модифицированные Т-клетки были обратно введены девочке, ее состояние резко ухудшилось, и она провела несколько недель в отделении интенсивной терапии на искусственной вентиляции легких. В какой-то момент жизнь Эмили висела на волоске, но в итоге девочка поправилась, и уже три года в ее организме врачи не находят даже единичных раковых клеток .

Побочные эффекты новой терапии

Несмотря на то, что иммуноцитотерапия Т-клетками с CAR является прорывом в области лечения опухолевых заболеваний, есть еще ряд опасностей, которые могут поджидать за углом. Доктор Карл Джун (Carl June ) из университета Пенсильвании был одним из первых, кто опубликовал успешные результаты лечения модифицированными Т-клетками, сравнил то, что происходит внутри тела пациента с «серийным убийством» и «массовым убийством». Когда миллиарды Т-клеток, которые были введены в организм, поделятся, то они смогут обнаружить и убить несколько фунтов опухоли. Но в этом тоже немало риска - многие пациенты страдают от синдрома высвобождения цитокинов (цитокинового шторма) - при борьбе Т-клетки с опухолевой клеткой высвобождается большое количество молекул цитокинов, что представляет угрозу для самого организма. Так, семь пациентов умерло вследствие этого синдрома .

Побочные эффекты связаны с мощной иммунной активностью модифицированных Т-клеток. Одним из камней преткновения является риск высокой токсичности, не позволяющий ввести подобное лечение на регулярной основе. «Т-клетки - действительно мощные создания» , - говорит профессор Венделл Лим (Wendell Lim ), заведующий отделом Департамента клеточной и молекулярной фармакологии Калифорнийского университета. - «Будучи активированными, они могут вызвать смерть. Нам необходима система удаленного контроля, которая сохранит силу этих модифицированных Т-клеток, и позволит специфично „общаться“ с ними и управлять Т-клетками, находящимися в организме» .

Т-клетки взяли под контроль

Ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско создали молекулярный «включатель», с помощью которого можно управлять действиями генноинженерных Т-лимфоцитов. Как и обыкновенные Т-клетки, несущие CAR, новые Т-клетки с «включателем» будут взаимодействовать с опухолевыми клетками, но не будут переходить «в атаку», пока не будет введен специальный препарат. Данный препарат является своеобразным «химическим мостиком» внутри Т-клеток: он запускает иммунные реакции, «включает» их, переводя в активное состояние. Когда препарат перестает циркулировать в крови, Т-клетки снова переходят в «выключенное» состояние (рис. 5).

Рисунок 5. Титруемый контроль генноинженерных Т-клеток с помощью включаемого химерного антигенного рецептора. С обычным CAR Т-клетки активируются при соединении с клеткой-мишенью, при этом из-за очень сильного иммунного ответа есть риск высокой токсичности. «Включаемый» CAR требует небольшую стимулирующую молекулу для запуска терапевтической функции. Величину ответа (например, «убийства» клеток-мишеней) можно титровать, тем самым уменьшая токсичность при уменьшении количества небольшой стимулирующей молекулы. Рисунок из .

Внедрение «пульта управления» в Т-клетку с химерным антигенным рецептором - это пример простой и эффективной стратегии совмещения собственных и автономных решений клетки (например, обнаружение сигналов болезни) с контролируемыми пользователем из вне. Перегруппировка и расщепление основных частей CAR обеспечивает возможность «включения» и «выключения» химерных антигенных рецепторов. Данная работа также подчеркивает важность разработки оптимизированных биоинертных «пультов управления», таких как небольшие молекулы и свет, вместе с их клеточными компонентами реагирования, в целях повышения точности контролируемой терапии .

Таким образом, правильно дозируя препарат, можно управлять уровнем иммунной активности модифицированных Т-клеток. В частности, благодаря данной технологии можно снизить отрицательные последствия синдрома высвобождения цитокинов. Также иногда нормальные клетки экспрессируют небольшие количества белков, которые являются мишенью для Т-клеток с CAR. Поскольку модифицированные Т-клетки вводят в кровяное русло и они проходят через сердце и легкие, ткани этих органов могут быть повреждены прежде, чем Т-клетки достигнут своих намеченных целей в других частях тела. А с новой технологией Т-клетки будут в «выключенном» состоянии, пока не достигнут цели .

Иммунотерапия с помощью Т-клеток с CAR успешна против рака крови, но, когда дело доходит до твердых опухолей, которые образуются в толстой кишке, молочных железах, мозге и других тканях, модифицированные Т-клетки до сих пор не показывают высокой эффективности. Возможно, метод дистанционного управления Т-клетками позволит разработать более мощные версии химерных антигенных рецепторов, которые позволят Т-клеткам поражать твердые опухоли, при этом не обладая серьезными побочными эффектами.

Литература

  1. Хороший, плохой, злой, или Как разозлить лимфоциты и уничтожить опухоль ;
  2. Rosenberg S.A., Packard B.S., Aebersold P.M., Solomon D., Topalian S.L., Toy S.T. et al. (1988). Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report . ;
  3. Regalado A. (2015). Biotech’s coming cancer cure . MIT Technology Review ;
  4. Farley P. (2015). ‘Remote control’ of immune cells opens door to safer, more precise cancer therapies . University of California San Francisco ;
  5. Wu C., Roybal K.T., Puchner E.M., Onuffer J., Lim W.A. (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor . Science . 350 , aab4077..

1 0 0
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.